液质联用测定乌鸡中氟喹诺酮的方法对比

徐少华，闫清华，刘国华，罗燕，谭磊

（深圳市农产品质量安全检验检测中心，广东深圳 518005）

液质联用测定乌鸡中氟喹诺酮的方法对比

徐少华，闫清华，刘国华，罗燕，谭磊

（深圳市农产品质量安全检验检测中心，广东深圳 518005）

以液相色谱-质谱/质谱法为基础，在试验前处理方面进行了优化，通过添加回收试验和阳性样品检测，对比液相色谱-质谱/质谱法和优化后的前处理两种方式试验的结果。优化的前处理过程：称取试样3.0 g，加入提取液10 mL，经球磨机研磨，超声波辅助提取，冷冻离心。移取上清液过固相萃取柱，移取净化液3.00 mL氮吹至0.5 mL，加入流动相定容，过0.22μm膜上机。10、50、100、200、800、5000μg·kg-16个浓度建立标准曲线，相关系数R均> 0.998。回收率试验10、50、200 μg·kg-13个浓度对比，回收率范围为85.6%～102.2%，RSD≤3.92%。20份不同浓度阳性样品，两种方法检测值的相对标准偏差为0.67%～19.6%。优化后的前处理方法不但操作简单，省时省力，大幅降低检测成本，而且测定值稳定可靠，可提高大批量鸡肉中氟喹诺酮类药物的阳性筛选效率。

液相质谱；氟喹诺酮；前处理；阳性样品；乌鸡

氟喹诺酮类（FQNS）药物是一类人工合成的广谱抗菌药，具有抗菌谱广、抗菌作用强、体内分布广泛、组织药物浓度高、蛋白结合率低、使用方便、不良反应小及价格低廉等特点[1]。广泛用于动物和人类的各种感染性疾病的治疗。随着在养殖中的广泛应用，仅20多年，耐药率已经达60%～70%[2]。FQNS类药物残留不但对人体有直接的危害，更为严重的是致病菌对其耐药性正逐渐增强，且已发现某些FQNS具有潜在致癌性，其残留问题已引起广泛的关注，各种残留检测方法也应运而生[3]。

目前我国对FQNS的检测已经常态化，各级监管单位都已将该类药物监控作为例行任务。氟喹诺酮类药物在乌鸡中的检出率比较高。兽药残留的检测主要分两个部分，即样品前处理和仪器检测，传统的前处理方法费时费力，工作量占整个检测过程的70%，分为提取、净化、浓缩、复溶4部分。本试验是将液相色谱-质谱/质谱法的前处理方法优化之后，在保证检测结果的准确性的前提下，可以将工作量和检测成本大大降低。

1 试验材料

1.1 设备与仪器

设备与仪器包括球磨机、AB SECIX4500 LCMS、高速冷冻离心机、固相萃取柱装置、氮吹仪、超声波清洗器、默克超纯水器。

1.2 试剂与材料

标准品：恩诺沙星（ENR）、环丙沙星（CIP）、达氟沙星（DAN）和沙拉沙星（SAR）均产自德国Dr. Ehrenslorfer公司，纯度均≥99.6%，甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯。

提取液：80乙腈+20水+0.2甲酸；

流动相：10甲醇+90水+0.2甲酸；

Waters Oasis®HLB 6cc（200 mg）Extraction Car⁃tridges固相萃取仪小柱；

Waters Oasis®PRiME HLB 6cc（200 mg）Extrac⁃tion Cartridges固相萃取小柱。

样品：乌鸡肉均为市售经初步测定后选择的阳性样品。

2 试验方法

2.1 仪器条件

流动相梯度条件见表1，质谱条件见表2。

色谱柱：Waters Acqdity ΜPLC@BEH C18 1.7 μm 3.0×100 mm；柱温：40℃；进样量：5.00 μL；离子化模式：ESI+；质谱扫描方式：MRM；离子源:电喷雾正离子源；电喷雾电压：5 495 V；辅助气温度：500℃。

表1 流动相梯度条件

表2 质谱条件

流动相条件：流速为0.3 mL·min-1。

2.2 工作曲线

取FQNS标准储备液（用甲醇溶解），用流动相稀释定容，配置成工作液，浓度分别为10、50、100、200、800、5 000 μg·kg-1。

2.3 前处理步骤

2.3.1 方法一

按照国标前处理方法，参考液相色谱-质谱/质谱法。

2.3.2 方法二

准确称取已切碎的试样3.0 g，置于已装好陶瓷珠的离心管中，加入提取液10 mL，经过球磨机充分研磨，放于超声波清洗器中超声5 min，置于冷冻离心机8 000 r·min-1，4℃条件下离心5 min。移取上清液5.0 mL于Waters Oasis®PRiME HLB 6cc（200 mg）Extraction Cartridges固相萃取小柱净化，用玻璃试管接住过柱液，待提取液全部自然流出，无需挤干，将净化液移取3.0 mL至带刻度的5 mL试管中，氮吹至0.5 mL，加入流动相定容至1.0 mL，涡旋混匀0.5 min，过0.22 μm水相膜，待上仪器测定。

3 结果与讨论

3.1 标准曲线及检出限

氟喹诺酮类药物保留时间、回归方程、相关系数和检出限见表3。由表3可知，以空白鸡肉样品为基质，添加浓度为20 μg·kg-1，按照上述方法二全过程进行预处理和测定，平行样品n=7，根据各样品检测值，计算出平均值X（0.096 7 μg·L-1）及标准偏差Sb（0.003 91），当被分析物的回收率在70%～120%时，可计算检出限如表3。

计算公式如下：检出限（MDL）=（k×Sb×C）/X，其中k为置信因子，一般取3。Sb表示相对标准偏差。

3.2 回收率试验对比

四种氟喹诺酮类药物残留加标回收率见表4。

表3 氟喹诺酮类药物保留时间、回归方程、相关系数和检出限

表4 4种氟喹诺酮类药物残留加标回收率（n=2）

加标回收率试验过程中，以两种方法分别做单点定量，进行不同浓度梯度的回收率测定对比。通过空白基质样品加标回收率试验对比，加标水平在10、50、200 μg·kg-1时，通过方法一和方法二做双平行回收率试验，前处理优化后的方法回收率均稳定，数据准确可靠。与液相色谱-质谱/质谱法的试验效果相近，表明该优化后的前处理方法比较稳定，可以用于大规模的检测筛查，是较为理想的检测方法。

3.3 阳性样品实测结果对比

阳性样品试验结果以及相对标准偏差见表5。

由表5可知，选取20份不同浓度等级的乌鸡肉阳性样品通过方法一和方法二两种前处理方法进行双平行试验测定，在乌鸡肉阳性样品检测中，通过两种不同前处理方法，试验测定的结果存在一定偏差，测定出的恩诺沙星浓度范围为2～5 100 μg·kg-1，环丙沙星测定浓度范围为4～100 μg·kg-1，同一份样品两种方法检测平均值的相对标准偏差范围为0.67%～19.6%，82.6%的检测结果通过方法一前处理的阳性样品检出值要稍高于方法二，但是提取效果接近。可能是因为氟喹诺酮类药物更容易从肌肉组织中提取出来，方法二中直接用乙腈水溶液作为提取剂的效果不如方法一的提取剂。但是由于鸡肉中富含大量脂肪和蛋白质，在液相色谱-质谱/质谱法的前处理方法过程中，EDTA-Mcll⁃vaine缓冲液会携带大量蛋白质、脂肪、氨基酸等干扰物质，样品组织提取液一般呈浑浊状态，即使通过冷冻离心，仍然无法有效去除干扰物，提取液进入固相萃取柱后，净化效果并不理想，而且会造成小柱的堵塞，前处理6个样品的时间约为6 h，增大了残留药物检测难度。通过改进后的方法二进行前处理，6个样品的时间缩至约2 h，而且步骤简单，回收率高，检测结果稳定，在保证一定的测定准确度的前提下，可以大幅提高工作效率，并且节省耗材及人工成本。鉴于我国日益重视食品安全问题，政府加大对畜禽产品的检测监督工作的背景下，可借鉴该改进后的前处理方法，在成本一定的情况下，相对于液相色谱-质谱/质谱法可以成倍增加检测筛查批次，在食品安全监控方面起到更加高效的监测目的。

表5 阳性样品实验结果以及相对标准偏差

[1]张家禾,孟婷,周作红,等.动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测方法的研究进展[J].中国畜牧兽医,2014,41（5）:262-266.

[2]潘媛,牛华,程晓云,等.高效液相色谱法检测六种氟喹诺酮类兽药残留前处理的优化[J].分析试验室,2011,30（5）:69-72.

[3]边永玲,李秀娟,郭建.氟喹诺酮类兽药残留检测方法研究进展[J].中国农学通报,2008,24（6）:28-31.

LC-MS Method of Determination of Fluoroquinolone in Silkie

XU Shaohua,YAN Qinghua,LIU Guohua,LUO Yan,TAN Lei

（Shenzhen Agricultural Product Quality Safety Inspection Testing Center,Shenzhen 518005,Guangdong China）

Based on liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry,the test pretreatment was opti⁃mized,by adding the recycling experiment and positive samples test,compared with liquid chromatography mass spec⁃trometry/mass spectrometry and the optimized pretreatment results.Optimization of pretreatment process:took sample 3.0 g adding extract 10 mL,grinding by ball mill,ultrasonic assisted extraction and refrigerated centrifuge.Moving the clear liquid to the solid phase extraction column,the purified liquid 3.00 mL nitrogen blowing to 0.5 mL,adding mo⁃bile phase capacitance over 0.22 um membrane computer.Test selected 10,50,100,200,800,5 000 u g·kg-1six lev⁃els to establish standard curve,correlation coefficient R was greater than 0.998.Recovery experiment was 10,50,200 ug·kg-1three concentrations of contrast,recovery range 85.6%～102.2%,RSD 3.92%or less.Twenty different con⁃centration positive sample of the two methods,relative standard deviation was between 0.67%～19.6%.The optimized pretreatment method was not only the operation simple,save time and effort,greatly reduce the testing cost,and stable and reliable measurements.The method could improve the mass of the chicken positive screening efficiency.

liquid mass spectrometry;fluoroquinolone;preliminary treatment;positive samples;silkie

S859.79+6；S831

A

1001-0084（2017）03-0006-04

2017-01-24

徐少华（1991-），男，浙江衢州人，助理工程师，主要从事于兽药残留检测工作。