XBP1在白癜风皮损及应激HaCaT细胞中的表达

李舒丽 杨钰琪 张伟刚 朱冠男 高天文 李春英



·论著·

XBP1在白癜风皮损及应激HaCaT细胞中的表达

李舒丽 杨钰琪 张伟刚 朱冠男 高天文 李春英

目的： 检测XBP1在白癜风皮损组织及H2O2诱导的HaCaT细胞中的表达。方法： H2O2处理体外培养的HaCaT细胞。Real time PCR检测白癜风皮损中及应激HaCaT细胞中XBP1的表达；ELISA检测应激HaCaT细胞中特异性抑制剂抑制XBP1活化前后IL-6和IL-8的表达。结果： 白癜风皮损和应激HaCaT细胞中XBP1 mRNA显著高于正常对照；应激HaCaT细胞中IL-6和IL-8水平高于空白对照组，抑制XBP1活化后两者分泌减少。结论： XBP1在白癜风皮损组织中显著上调，促进应激的HaCaT细胞分泌IL-6、IL-8。

XBP1； 角质形成细胞； 白癜风

白癜风是一种常见的自身免疫性疾病，我们及国外多项研究表明内质网应激在启动白癜风自身免疫中发挥关键作用。内质网应激导致内质网内未折叠或错误折叠的蛋白蓄积，引起未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)。UPR主要表现为激活PERK-eIF2α，IRE1α-XBP1，ATF6三条信号通路，最终减轻或中止内质网应激反应，恢复细胞内环境稳态[1]。国内外多项遗传学研究表明XBP1基因多态性显著增加白癜风发病风险[2,3]，但机制不清。当细胞发生UPR时IRE1α激活，能从XBP1 mRNA中特异剪切26个碱基的内含子，改变XBP1 mRNA阅读框，其翻译产物XBP1-s(活化型XBP1)可作为转录因子进入细胞核，调控UPR下游靶基因及多种细胞因子的表达，参与疾病发生及进展[4]。最近有研究发现，在氧化应激条件下，黑素细胞中XBP1表达活化促进炎症介质释放，参与白癜风发病[5]。事实上，白癜风表皮角质形成细胞也存在内质网应激损伤[6,7]，基于其在表皮分布的数量及其产生炎症介质的能力，我们推测其在白癜风局部免疫微环境中也发挥重要作用。因此，本课题旨在明确XBP1在白癜风组织及应激角质形成细胞中的表达，进一步研究其对白癜风局部免疫微环境的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 HaCaT细胞系本室常规保存，1640培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司。细胞总RNA提取试剂盒购自日本Takara公司。兔抗人XBP1抗体购自美国Abcam公司，兔抗人XBP1-s抗体购自Protein Teq公司，鼠抗人β-actin 单克隆抗体购自Sigma公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG购自康为世纪生物科技公司。水杨酸(SA)、雷帕霉素(RA)购自Sigma公司。IL-6、IL-8 ELISA检测试剂盒购自美国RD公司。

1.2 方法

1.2.1 组织样本的收集与保存 收集6例进展期白癜风患者皮损组织样本，所有入选患者未伴发其他自身免疫性疾病且局部皮损无感染，患者皮损标本均于我科皮肤病理中心采用皮肤活检的方法切取约1.0 cm×0.5 cm全层皮组织，健康皮肤对照组织来源于西京医院整形科接受美容手术的非曝光部位正常全层皮组织。所有入组患者及对照均签署知情同意并得到第四军医大学西京医院伦理委员会同意。所有样本于液氮中冻存待后续实验。

1.2.2 HaCaT细胞培养及处理 HaCaT使用含10% FBS的1640培养基于37℃、5% CO2条件下培养。待HaCaT细胞生长至50%～60%融合时更换无血清培养基，16 h后予以0.5 mM H2O2处理24 h，收集细胞裂解液及上清用于后续检测；为了抑制XBP1活化，采用其特异性抑制剂水杨酸(RA)[8]及雷帕霉素(RA)[9]预处理，即对HaCaT细胞予以SA(100 μM)、RA(100 nM)预处理6 h，对照组予以DMSO处理，之后予以0.5 mM H2O2处理24 h，收集细胞裂解液及上清用于后续检测。

1.2.3 Real-time PCR检测 Trizol试剂提取组织及细胞总RNA，按照试剂盒说明反转录成cDNA后进行Real-time PCR检测，以β-actin表达量为内参照，采取2-△△CT方法计算各基因表达变化的相对倍数。内质网应激相关分子引物设计如下：PERK：正向引物5'-GGAAACGAGAGCCGGATTTATT-3'及反向引物5'-ACTATGTCCATTATGGCAGCTTC-3'；IRE1α：正向引物5'-CACAGTGACGCTTCCTGAAAC-3'及反向引物5'-GCCATCATTAGGATCTGGGAGA-3'；ATF6：正向引物5'-TCCTCGGTCAGTGGACTCTTA-3'及反向引物5'-CTTGGGCTGAATTGAAGGTTTTG-3'；eIF2α：正向引物5'-CCGCTCTTGACAGTCCGAG-3'及反向引物：5'-GCAGTAGTCCCTTGTTAGTGACA-3'；XBP1：正向引物5'-TATCCTGTTGGGCATTCTGGAC-3'及反向引物：5'-AGAAAGGGAGGCTGGTAAGGA-3'；XBP1-s：正向引物5'-GCTGAGTCCGCAGCAGG-3'及反向引物5'-GTCCAGAATGCCCAACAGGA-3'。

1.2.4 XBP1活化检测：提取细胞总RNA，采用PCR扩增获得XBP1 mRNA产物，XBP1引物序列为：正向引物5'-CTGAAAAACAGAGTAGCAGCTCA-3'及反向引物5'-TGGGTAGACCTCTGGGAGCTCCT-3'。由于XBP1比活化型XBP1-s多26个碱基，该26个碱基序列上含有Apa-LI特异酶切位点，因此对扩增的XBP1 mRNA进行酶切反应，所得产物凝胶电泳，非活化型XBP1则被酶切为两个片段，分别为278 bp和195 bp，而活化型XBP1(XBP1-s)则为447 bp大小的一个片段。

1.2.5 Western blot检测 收集实验处理组及对照组HaCaT细胞，RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白，经BCA法测定蛋白含量后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(5%浓缩胶，12%分离胶)。PVDF膜经甲醇激活后转膜。转膜后用TBST稀释的5%脱脂奶粉室温封闭1～4 h，予XBP1、XBP1-s及β-actin等一抗4℃孵育过夜。次日予以辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG二抗室温孵育50 min。使用化学发光仪检测结果。

1.2.6 ELISA检测 收集实验组及对照组细胞上清，严格按照ELISA检测试剂盒操作说明检测IL-6、IL-8分泌水平。

1.2.7 统计学方法 采用Graphpad Prism 5统计软件进行分析。组间检验采用one-way anova检验法，各组数据两两比较，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白癜风皮损组织中内质网应激相关分子表达情况 采用Real-time PCR检测内质网应激相关分子PERK、eIF2α、ATF6、IRE1α、XBP1、活化型XBP1(XBP1-s) mRNA表达变化。结果显示，白癜风皮损周ATF6表达下降，PERK、eIF2α、IRE1α、XBP1 mRNA表达水平均升高，但以XBP1及XBP1-s上调最显著，分别为13.36±2.10倍和7.63±1.03倍(图1)。

2.2 H2O2诱导HaCaT细胞XBP1及细胞因子IL-6、IL-8表达分泌情况 以H2O2处理HaCaT细胞24 h后，Real-time PCR结果显示XBP1及XBP1-s分别上调14.84±3.26倍和13.32±2.71倍(图2a)，进一步Western blot检测确定XBP1及其活化型XBP1-s表达也升高(图2b)；采用ELISA检测细胞上清中分泌细胞因子IL-6、IL-8的水平，发现H2O2处理后，HaCaT细胞分泌的IL-6由(28.75±5.40)pg/mL上调至(63.50±8.99)pg/mL，IL-8由(46.47±5.65)pg/mL上调至(294.4±15.25)pg/mL(图2c、d)。以上研究提示，应激的角质形成细胞中，XBP1表达升高且其活性增强，并可促进细胞因子IL-6、IL-8的分泌。

2.3 抑制XBP1活化对H2O2诱导HaCaT细胞分泌IL-6、IL-8的影响 我们在HaCaT细胞接受H2O2处理前，使用XBP1活化的特异性抑制剂预处理6 h发现水杨酸SA及雷帕霉素RA预处理均可明显抑制H2O2诱导的XBP1活化(图3a)，且能显著抑制H2O2对IL-6、IL-8的诱导效应(图3b、c)。以上结果提示XBP1活化是促进角质形成细胞分泌细胞因子IL-6、IL-8的关键。

图1 白癜风皮损周内质网应激关键分子表达水平变化(n=5，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

图2 a:H2O2处理HaCaT细胞后XBP1 mRNA及XBP1-s mRNA水平(n=4，***P<0.001)；b:蛋白表达活化水平；c:细胞因子IL-6分泌水平(n=4，*P<0.05);d:IL-8(n=4，***P<0.001)分泌水平

图3 a:XBP1活化抑制剂SA、RA的抑制效率;b、c：SA、RA对H2O2诱导HaCaT细胞分泌IL-6(n=4，*P<0.05，**P<0.01)和IL-8(n=4，**P<0.01，***P<0.001)的影响

3 讨论

大量研究证实，氧化应激是白癜风发病的重要原因，其引起的T细胞自身免疫反应是表皮黑素细胞破坏的关键效应环节[10]，然而氧化应激启动T细胞免疫应答的具体机制尚不完全清楚。近年来有学者提出，氧化应激可播散至内质网，形成内质网应激激活未折叠蛋白反应UPR，适度的UPR维持内质网内环境稳态，促进细胞生存；而过度激活的UPR促进下游一系列炎症因子、趋化因子的表达及分泌，导致局部免疫微环境紊乱，参与疾病的发生发展[1,4]。以往有研究证实白癜风患者黑素细胞、角质形成细胞内质网均有损伤，表明白癜风表皮存在内质网应激[6,7]。我们通过检测UPR的3条信号通路关键分子表达，首次发现PERK-eIF2α、IRE1α-XBP1信号在白癜风皮损组织均显著升高，以XBP1上调最显著。

国内外GWAS研究表明，XBP1基因多态性与白癜风发病密切相关[2,3]。以往有研究报道XBP1可激活MHC II类基因表达，调控浆细胞分化及炎症因子表达，参与多种自身免疫反应以及肿瘤免疫的调控[2]。Toosi等发现酚剂处理诱导黑素细胞发生内质网应激，可激活未折叠蛋白反应UPR，启动一系列炎症因子表达[5]。除了黑素细胞，我们的研究首次发现，应激的角质形成细胞也发生内质网应激，其标志分子XBP1表达显著上调，并进一步证实XBP1活化促进角质形成细胞促炎介质IL-6、IL-8的释放。以往有研究证实IL-6可以上调黑素细胞ICAM表达，促进T细胞与黑素细胞的接触，增强其杀伤效应[11]。IL-8也被证实在白癜风皮损高表达[12]，可能促进皮损局部T细胞迁移，放大炎症反应。综合以上研究我们推测，应激的角质形成细胞激活XBP1，促进IL-6、IL-8的分泌，加重白癜风局部免疫紊乱，放大炎症反应。此外，基于角质形成细胞在表皮中的分布数量及其释放炎症因子的能力，我们推测应激的角质形成细胞相较于黑素细胞，在白癜风免疫微环境中可能发挥更重要的作用。

综上，本研究证实XBP1在白癜风组织表达显著上调，且证实角质形成细胞在氧化应激条件下，活化XBP1信号促进炎症因子IL-6、IL-8的释放。我们的研究为XBP1参与白癜风发病提供了新的证据，进一步证实了XBP1活化在氧化应激诱导白癜风异常免疫中起重要作用。

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(收稿：2016-09-07 修回：2016-11-10)

Expression of XBP1 in vitiligo lesions and stressed keratinocytes

LIShuli,YANGYuqi,ZHANGWeigang,ZHUGuannan,GAOTianwen,LIChunying.

DepartmentofDermatology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China

LIChunying,E-mail:lichying@fmmu.edu.cn

Objective: To detect the expression level of XBP1 in vitiligo lesions and stressed HaCaT cells. Methods: The cultured HaCaT cells were treated by H2O2. The levels of XBP1 mRNA in the lesions of vitiligo and stressed HaCaT cells were detected by Real-time PCR. The level of IL-6 and IL-8 secretion were detected by ELISA in stressed HaCaT cells before and after treatment with XBP1 inhibitors. Results: The levels of the XBP1 mRNA expression in the lesions of vitiligo and stressed HaCaT cells were higher than that in the control group. The levels of IL-6 and IL-8 in the stressed HaCaT cells were higher than those in the normal HaCaT cells and decreased after the activation of XBP1 was inhibited. Conclusion: The expression level of XBP1 is up-regulated and promote the secretion of IL-6 and IL-8 in the stressed keratinocytes.

XBP1; keratinocytes; vitiligo

国家自然科学基金资助项目(编号:81602764,81502863)

第四军医大学西京皮肤医院，西安，710032

李春英，E-mail: lichying@fmmu.edu.cn