液质联用法测定不同形态丹参药品中3种水溶性成分含量

赵国欣，孙浩冉，姚 虹

(郑州工程技术学院 化工食品学院，郑州 450044)

液质联用法测定不同形态丹参药品中3种水溶性成分含量

赵国欣，孙浩冉，姚 虹

(郑州工程技术学院 化工食品学院，郑州 450044)

建立了同时测定不同形态丹参药品中原儿茶醛、丹酚酸B、迷迭香酸3种成分含量的超高效液相色谱-质谱联用分析方法。采用Hypersil Gold C18(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)色谱柱，以0.1%甲酸溶液-甲醇为流动相梯度洗脱，流速0.300 mL·min-1,柱温为30℃。采用电喷雾离子源(ESI)，选择反应离子检测(SRM)模式。结果显示，原儿茶醛、丹酚酸B、迷迭香酸线性范围均为0.10～1000ng·mL-1，检测限为0.05 ng·mL-1。

液质联用；原儿茶醛；丹酚酸B；迷迭香酸；选择反应离子监测

丹参又名赤参、紫丹参、红根等，为唇形科植物，主要分布于四川、山西、河北、江苏、安徽、河南等地。丹参的干燥根和根茎具有活血祛瘀、凉血消肿等功效，可用于心血管系统疾病的治疗[1]。丹参的有效成分分为水溶性和脂溶性两类。根据文献报道，水溶性成分多为邻苯二羟基类化合物，主要有丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸等[2-4]；脂溶性成分主要有隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA、二氢丹参酮等[5-6]。

对于丹参成分的分析，涉及药材、片剂、滴丸、针剂和口服液等[7-11]。目前测定方法主要有超高效液相色谱(UPLC)法[4]、高效液相色谱-二极管阵列检测(HPLC-DAD)法[2，12]、快速液相色谱-串联质谱(UFLC-MS/MS)法[13]以及超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法[14]。采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法同时检测丹参中3种水溶性成分含量，可在5.1min内完成一次色谱分析，操作简便，线性范围宽，分析方法快速、准确。

1 仪器与试剂

1.1 主要仪器

UltiMate 3000 超高效液相色谱仪：美国Thermo公司；TSQ Quantum Access Max三重四级杆液质联用仪：美国Thermo公司；Milli-Q system超纯水仪：美国Millipore公司； XSE205DU半微量分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；KQ-50B型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.2 原料与试剂

对照品原儿茶醛(批号110810-201007)、丹酚酸B(批号111562-201313)：中国食品药品检定研究院提供；迷迭香酸(批号MUST-14020115)：成都曼思特生物科技有限公司提供；复方丹参片(国药标准字 Z15020566)：内蒙古仁泽药业有限公司；复方丹参片(国药标准字 Z44022225)：广东一力集团制药有限公司；复方丹参滴丸(国药准字 Z1095011)：天士力制药集团股份有限公司；丹参注射液(国药准字 Z51021303)：四川升和药业股份有限公司；甲醇、甲酸：色谱纯，德国Merck公司；水为高纯水(Millipore system)。

2 方法与结果

2.1 色谱-质谱条件

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil Gold C18(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)；流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为甲醇，梯度洗脱条件见表1；流速0.300 mL·min-1,柱温30℃,进样量5 μL。

表1 洗脱梯度

2.1.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；喷雾电压：3kV；蒸汽压温度：400℃；鞘气压力：40psi；辅助气压力：10psi；毛细管(离子传输管)温度：320℃。

检测方式：选择反应检测(SRM)。各组分监测离子对及相关参数设定见表2。

表2 质谱参数

注：*为定量离子。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品储备液

准确称取3种对照品各2.5 mg，分别用甲醇溶解，然后定容至25 mL，于4℃下冷冻保存。

分别精密量取上述对照品溶液1.0 mL，然后用甲醇定容至10 mL，制成浓度为10 μg·mL-1的混合标准溶液，于4℃下冷冻保存。

2.2.2 供试品溶液

准确称取样品1.0 g(固体样品需去糖衣，研细)，分别用甲醇溶解，超声10 min， 静置放冷，用甲醇定容至100 mL，摇匀，用0.22 μm的滤膜过滤。取滤液，按一定比例稀释。

2.3 检测限和定量限的测定

分别取对照品储备液适量，用50%甲醇水溶液稀释，按上述色谱-质谱条件进行测定。根据3倍和10倍信噪比计，测定检出限和定量限，结果如下：原儿茶醛(LOD 0.05 ng·mL-1，LOQ 0.1 ng·mL-1)；丹酚酸B(LOD 0.05 ng·mL-1， LOQ 0.1 ng·mL-1)；迷迭香酸(LOD 0.05 ng·mL-1，LOQ 0.1 ng·mL-1)。

2.4 线性关系考察

精密量取混合对照品储备液适量，用50%甲醇水溶液稀释成0.1，0.2，0.5，1，5，10，50，100，500，1000 ng·mL-1系列浓度混合对照品溶液，经0.22 μm滤膜过滤后，进行UPLC-MS/MS分析，记录色谱图如图1所示。

将上述系列混合对照品溶液分别按色谱-质谱条件进样分析，以3种化合物的浓度为横坐标，以检出峰面积为纵坐标进行线性回归。实验结果见表3。

2.5 加样回收率试验

在100 μg·mL-1样品中添加浓度相当于10 ng·mL-1，100 ng·mL-1，1000 ng·mL-1的高、中、低3种浓度混合对照品溶液，每个浓度溶液6份，测得回收率见表4。结果表明，各化学药物回收率和精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一份供试品溶液，分别于0h，6h，12h，18h，24h进样测定，结果显示各成分的峰面积RSD分别为：原儿茶醛0.94%、丹酚酸B 1.2%、迷迭香酸0.75%，表明供试品溶液在24 h内保持稳定。

2.7 样品测定

将上述分析方法用于各类丹参药材3种成分的含量测定，结果见表5。不同种类制剂的丹参药材中活性成分的含量存在明显的差异。

3 讨论

3.1 萃取条件的优化

本文分别考察了甲醇、50%甲醇水溶液、乙腈等提取溶剂，结果发现采用甲醇和乙腈提取效果好。综合考虑提取效率及成本，最终选择甲醇为提取溶剂。

3.2 色谱分离条件

本文分别考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液(含5mmol·L-1乙酸铵)、乙腈-水等流动相体系，结果发现采用甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相体系色谱分离情况最好。

4 结论

本文建立的超高效液相色谱-串联质谱法可多组分同时检测丹参药品中有效成分含量，该方法专属性强、灵敏度高、准确度好，检测速度快。用该法同时测定不同形态丹参药品中原儿茶醛、丹酚酸B、迷迭香酸3种成分含量，采用Hypersil Gold C18(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)色谱柱，以0.1%甲酸溶液-甲醇为流动相梯度洗脱，流速0.300 mL·min-1，柱温为30℃。采用电喷雾离子源(ESI)，选择反应离子检测(SRM)模式。结果显示，原儿茶醛、丹酚酸B、迷迭香酸线性范围均为0.10～1000ng·mL-1，检测限为0.05 ng·mL-1。

图1 3种对照品提取离子(定量)LC-MS图谱

表3 3种化学药物的回归方程和相关系数

组分线性范围/ng·mL-1回归方程r原儿茶醛0.10-1000Y=-235.871+252.568*X0.9969丹酚酸B0.10-1000Y=-528.139+1009.03*X0.9987迷迭香酸0.10-1000Y=-16.5308+768.545*X0.9990

表4 3种化学药物的加样回收率(n=6)

表5 样品测定结果

[1]王慕邹，陈毓亨.常用中草药高效液相色谱分析[M]. 北京:科学出版社，1999.

[2]王伟，张雪，褚文静，等.高效液相二极管阵列检测法同时测定丹参粉针剂中4种水溶性成分的含量 [J].中成药,2011,33(2):266-269.

[3]赵静，李玉琴，段瑞，等.高效液相色谱法测定百花丹参3种炮制品中5种酚酸类成分的含量[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(23):154-157.

[4]李耿，孟繁蕴，杨洪军，等. UPLC法同时测定丹参中11种成分的含量 [J].中国药房，2014,25(19):1766-1768.

[5]张琳琳，王淳，宋志前，等. HPLC 同时测定白花丹参中丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和二氢丹参酮Ⅰ的含量[J].中国实验方剂学杂志.2015,21(6):62-65.

[6]施超欧，陶萍.丹参注射液主要成分的HPLC及LC-MS定性分析 [J].世界科学技术, 2001(5):29-33.

[7]汤杰，宋冰娜，郑盼，等.HPLC测定冠心丹参胶囊中主成分的含量[J].中国现代中药, 2015,17(10)：1078-1082.

[8]张锋忠，骆天功.HPLC法测定丹参益坤口服液中丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ及隐丹参酮的含量[J].中药材, 2015,38(8)：1745-1746.

[9]索志荣,秦海燕,曹炜,等.复方丹参片中四种成分的高效液相色谱-电化学检测-紫外检测法分析[J].色谱,2005,123(6)：626-629.

[10]刘翔，陈向明.高效液相色谱法测定丹参饮片中丹参酮ⅡA的含量[J].福建分析测试,2015,24(1)：36-38.

[11]张雪，褚文静，刘伟娜，等.高效液相色谱二极管阵列检测法同时测定丹参滴注液中四种水溶性成分的含量 [J].分析科学学报,2010,26(1)：109-112.

[12]韦英杰,李萍,李松林.高效液相二极管阵列检测法同时测定复方丹参制剂中7个成分的含量[J].分析化学,2006,34(12)：1702-1706.

[13]Xu Y P,Huang K X,Pan Y,et al. A Rapid UFLC-MS/MS Method for Simutaneous Determination of Formononetin,Cryptotanshinone,Tanshinone IIA and Emodin in Rat Plasma and Its Application to a Pharmacokinetic Study of Bu Shen Huo Xue formula[J].Journal of Chromatography B,2013,932,92-99.

[14]赵国欣，刘萌，李领川,等. 超高效液相色谱-串联质谱法同时测定中草药丹参中7种成分含量[J].中国实验方剂学杂志,2017,23(1):60-63.

(责任编辑 姚虹)

The Determination of Three Kinds of Water-soluble Components in Salvia Miltiorrhiza of Different Form by UPLC-MS/MS

ZHAO Guo-xin, SUN Hao-ran, YAO Hong

(College of Chemical Industry and Food, Zhengzhou Institute of Technology, Zhengzhou 450044, China)

A rapid analytic method for the simultaneous determination of protocatechualdehyde, salvianolic acid B and rosmarinic acid in salvia miltiorrhiza of different form was established by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS). The column was Hypersil Gold C18 (2.1mm×100mm，1.9μm) and the column temperature was set at 30℃. The mobile phase was consisted of 0.1% acetic acid and methanol with gradient elution and the flow rate was 0.300mL·min-1. Selective reaction monitoring (SRM) mode was used with electrospray ionization (ESI) source. The calibration curves of protocatechualdehyde, salvianolic acid B and rosmarinic acid were linear in the range of 0.10-1000ng·mL-1. The detection limits were 0.05 ng·mL-1.

UPLC-MS/MS; Protocatechualdehyde; Salvianolic Acid B; Rosmarinic Acid; SRM

2017-03-05

河南省重点科技公关项目(152102210016；152102310130)

赵国欣(1980—)，女，河南焦作人，硕士，郑州工程技术学院化工食品学院讲师，主要从事食品药品仪器分析检测研究。

10.13783/j.cnki.cn41-1275/g4.2017.02.024

R286.0

A

1008-3715(2017)02-0105-04