延边黄牛γ-干扰素基因的克隆与序列分析

尹昌善， 张立霞， 薛书江， 宋建臣， 李海峰， 许应天*

(1.和龙市动物检疫站,吉林 和龙 133500;2.延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

延边黄牛γ-干扰素基因的克隆与序列分析

尹昌善1， 张立霞2， 薛书江2， 宋建臣2， 李海峰2， 许应天2*

(1.和龙市动物检疫站,吉林 和龙 133500;2.延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

应用刀豆素蛋白(ConA)和植物分裂素( PHA) 双重诱导培养延边黄牛脾淋巴细胞，提取脾淋巴细胞总RNA，RT-PCR扩增延边黄牛γ-干扰素基因，并将其克隆到pMD-18-T simple载体中，进行PCR鉴定和酶切鉴定及测序。结果表明：成功克隆了462 bp大小的延边黄牛γ-干扰素基因片段；所克隆基因片段序列与欧洲牛、印度牛的亲缘关系最近，同源性分别为99.8%和99.6%，与欧洲牛的氨基酸同源性为100%。本试验为进一步研究延边黄牛γ-干扰素生物学作用奠定了基础。

延边黄牛；γ-干扰素基因；克隆；序列分析

干扰素( interferon，IFN) 是主要由NK 细胞和T 细胞产生的一类功能调节蛋白，具有抑制细胞分裂、广谱抗病毒及免疫调节等功能[1]。自Cerrett[2]等于1986年首先克隆出乳牛IFN-γ基因后，就受到广泛关注，干扰素生物制剂的开发应用已成为研究热点[3-9]，但至今尚未有关于延边黄牛IFN-γ基因的相关报道。

本试验旨在克隆延边黄牛IFN-γ基因，为今后进一步研究IFN-γ 对提升延边黄牛的抗病能力及免疫佐剂作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

脾淋巴细胞从延吉市兴隆牧场健康延边黄牛脾脏无菌分离制备。

1.2 主要试剂

限制性核酸内切酶BamHⅠ和Hand Ⅲ、Ex-Taq DNA聚合酶、牛淋巴细胞分离液、DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、M-MLV鼠源反转录酶、Marker(DL-2000)、RNA小量提取试剂盒、质粒提取试剂盒、T4连接酶pMD-18-T simple 载体和感受态E.coliBL21,均购自大连宝生物公司；ConA、PHA、胎牛血清(FBS)、RPMI1640,均购自Sigma公司；其它试剂均为分析纯。

1.3 引物的设计与合成

根据GenBank登录的牛IFN-γ基因序列(登录号为M29867)设计1对引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

上游引物F：5′-GCGGATCCGCTTTACTGCTCTGTGGGCT-3′ BamHⅠ

下游引物R：5′-GCAAGCTTTCTGACTTCTCTTCCGCTTTC-3′ Hand Ⅲ

1.4 脾淋巴细胞的分离与活化

按说明书分离脾淋巴细胞，将PHA(1.5 μg/mL)、ConA(30 μg/mL)、FBS(10%)、L-谷氨酰胺(2 mmol/L)、(100×)双抗(青霉素和链霉素)加入到RPMI1640培养液悬浮细胞。取适量细胞至100 mL培养瓶内，放CO2培养箱中37 ℃培养36 h。

1.5 总RNA的提取及RT-PCR

将细胞总RNA 8 μL、1 μL 50 μM的通用引物Oligo(dT)18和DEPC水1 μL混匀，70 ℃水浴10 min，迅速冰浴2 min，瞬离。在上述10 μL溶液中加入dNTP Mixture(各10 mM)2 μL、5×M-MLV Buffer4 μL、1 μL RTase M-MLV(200 U/μL)、0.5 μL RNase Inhibitor(40 U/μL)、2.5 μL DEPC水，42 ℃水浴1 h，70 ℃水浴15 min，冰浴备用。

1) 25 μL PCR扩增体系：Ex-Taq DNA聚合酶0.15 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，dNTP 2 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，DEPC水16.35 μL。

2) PCR扩增反应程序：94 ℃，5 min；94 ℃，45 s；58 ℃，45 s；72 ℃，1 min；30个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增后，取PCR产物，凝胶电泳，观察结果。

1.6 目的基因的克隆

回收PCR产物，与pMD-18-T simple载体16 ℃连接2 h，转化至感受态细胞。涂板，培养，挑取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃摇菌过夜，质粒提取试剂盒提取阳性质粒。

1.7 阳性质粒的鉴定及测序

将提取的质粒进行Hand Ⅲ和BamHⅠ双酶切鉴定和PCR鉴定，并将鉴定为阳性的克隆送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序。利用DNAStar软件，进行序列分析。

2 结果与分析

2.1 延边黄牛IFN-γ基因的RT-PCR扩增

从PHA和ConA双重诱导的牛脾淋巴细胞中提取总RNA，通过RT-PCR扩增，获得1条462 bp的特异条带，结果与预期目的片段相符(图1)。

图1 RT-PCR产物电泳结果

2.2 重组克隆质粒的鉴定

重组克隆质粒经PCR鉴定和BamHⅠ、Hand Ⅲ双酶切鉴定，1%琼脂糖电泳后，得到了与预期大小一致的特异性片段(图2)。

图2 pMD-18-IFN-γ的PCR和酶切鉴定图谱

2.3 序列测定与分析

用DNAStar软件进行核苷酸和氨基酸同源性分析，结果无论在核苷酸还是在氨基酸水平，所得序列与其它动物的IFN-γ基因序列之间均有较高同源性(图3)，即同种之间同源性很高，其中，与欧洲牛的氨基酸同源性为100%；与反刍兽之间同源性也较高，均高于95%以上，而与犬属动物的同源性最低。

由图4可知，延边黄牛IFN-γ基因与欧洲牛、印度牛处在同一进化分支，延边黄牛与欧洲牛的亲缘关系最近，与犬的亲缘关系最远。

图3 IFN-γ基因序列和氨基酸序列的同源性比较

图4 IFN-γ基因序列的系统发育树

3 讨论与结论

延边黄牛是吉林省延边朝鲜族自治州地区役肉兼用黄牛品种，是中国5大地方良种牛之一，是中国畜禽品种基因库中极其珍贵的财富。因延边黄牛品种特征和肉品特性优良，具有鲜明的地域特色，成为中国国家地理标志产品。延边黄牛的肉质品味独具特色，而且肉质明显优于其它牛肉，特别是有益于人体健康的不饱和脂肪酸、油酸含量明显高于其它牛[10]。但由于经贸活动的频繁，延边黄牛相继发生各种疫病，严重影响延边黄牛业的迅速健康发展。干扰素(interferon，IFN) 是主要由 T 细胞和 NK 细胞产生的一类功能调节蛋白，具有广谱抗病毒、抑制细胞分裂及免疫调节等功能。因此，开展本研究成功克隆了延边黄牛IFN-γ基因。

目前，在克隆细胞因子基因时，大多用ConA[11]、PHA[12]和LPS[13]等诱导剂，也有报道无需用诱导剂[14]。认为这可能与不同组织中目的基因含量多少有关。综合考虑本研究采用了ConA和PHA双重诱导方法，从脾淋巴细胞中成功克隆出延边黄牛IFN-γ基因。

通过对延边黄牛IFN-γ基因的生物信息学分析发现，无论从核苷酸序列还是氨基酸序列来看，所克隆的延边黄牛IFN-γ基因与欧洲牛、印度牛、羊和绵羊等反刍兽有较高的同源性(95%以上)，与欧洲牛的氨基酸同源性高达100%，而与其他种动物之间差异较大。说明牛γ-干扰素没有品种特异性，但有种特异性。该结果与熊毅等报道的基本一致[3]。

本研究是延边黄牛IFN-γ生物学功能研究的前期工作。这次成功克隆了延边黄牛IFN-γ基因，为今后进一步将延边黄牛IFN-γ用于延边黄牛疫病防治奠定了基础。

[1] 于慧,张瑞雪,王好,等.鲤I-IFN-γ作为锦鲤疱疹病毒核酸疫苗免疫佐剂的效果研究[J].中国兽药杂志,2016,50(08):9-15.

[2] Cerretti D P,McKeregban K.Cloning,sequence and expression of bovine interferon gamma [J].J Immunol,1986,136(12):4561-4564.

[3] 熊毅,朱伟,徐贤坤,等.广西水牛γ干扰素基因的克隆与序列分析[J].动物医学进展,2007,28(09):19-23.

[4] 李晓婷,宋佰芬,崔玉东.鸡白介素18与鸡γ干扰素基因融合表达载体构建[J].黑龙江八一农垦大学学报,2017,29(01):49-53.

[5] 涂浩,赵星灿,杨占娜,等.猪重组IL-2、IL-4和IFN-γ对口蹄疫合成肽疫苗的免疫增强作用研究[J].畜牧兽医学报,2015,46(08):1390-1399.

[6] 曹永生,徐黎明,赵景壮,等.重组虹鳟IFN-γ2的原核表达及抗IHNV活性分析[J].水产学报,2016,40(10):1586-1594.

[7] 黄道超,张志和,杨光友,等.大熊猫 γ- 干扰素基因的克隆与序列分析[J].中国预防兽医学报,2008,30(01):35-38．

[8] 王芳,胡波,任雪枫,等.新西兰白兔 γ-干扰素在昆虫细胞中的表达及其活性测定[J].华北农学报,2010,25(03) :9-13.

[9] 刘颖，王冰，于清龙，等.梅花鹿 γ-干扰素在不同真核细胞系中稳定表达的研究[J]．中国畜牧兽医,2010,37(05)：85-89.

[10] 王慧明,吕爱辉,李香子,等.硫磺负离子复合制剂对延边黄牛生长性能、养分表观消化率和屠宰性能的影响[J].动物营养学报,2014,26(01):203-209.

[11] 徐正中,陈祥,单锋丽,等.牛γ干扰素的表达及其抗病毒活性测定[J].生物工程学报,2011,27(02):269-276.

[12] 陈耿，华利忠，张书霞. 猪圆环病毒2型对体外培养仔猪淋巴细胞转化能力及其活性的影响[J].中国兽医科学,2009(12):1051-1056.

[13] 曹荣峰，崔晓妮，张乃生.孕酮对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞表达TNF-α、IL-1β、TLR4、CD14和MD2的影响[J].中国兽医学报,2012,32(10):1526-1531.

[14] 郑兰兰,崔保安,陈红英,等.猪白细胞介素18全基因的克隆、真核表达质粒的构建及其在猪肾细胞中的表达[J].中国兽医学报,2009,29(01):30-35.

Cloning and sequence analysis of IFN-γ gene in Yanbian bovine

YIN Changshan1, ZHANG Lixia2， XUE Shujiang2， SONG Jianchen2， LI Haifeng2， XU Yingtian2*

(1.AninalQuaraneineStationofHelongCity,HelongJilin133500,China;2.AgricultralCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

The Yanbian cattle IFN-γ gene was amplified by RT-PCR from total RNA of Yanbian cattle spleen lymphocytes double induced and cultured by ConA and PHA. IFN-γ gene was cloned into PMD-18-T simple vector,and operated on PCR identification and restriction enzyme digestion and sequencing. The results showed that Yanbian cattle IFN-γ gene was successfully cloned; The Yanbian cattle IFN-γ gene was closest with European cattle IFN-γ gene and Indian cattle IFN-γ gene in genetic relationship, and the homology of genetic sequence were 99.8% and 99.6%. In addition, the homology of amino acid was 100% between Yanbian cattle IFN-γ gene and European cattle IFN-γ gene. The experiment laid the foundation for the further study of biological effects of Yanbian cattle IFN-γ.

Yanbian cattle；IFN-γ gene；clone；sequence analysis

2017-01-15 基金项目：吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(吉教科合字[2015]第16号)

尹昌善(1962—)，男(朝鲜族)，吉林和龙人，高级兽医师，研究方向为动物检疫，许应天为通信作者，E-mail：ytxu@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)01-0083-04

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.01.015

S823

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