茉莉酸甲酯对生物反应器培养高山红景天愈伤组织有效物质积累的影响

管 桐, 李 贺, 王洪秋, 代 月

(1.延边大学农学院，吉林 延吉 133002；2.延边朝鲜族自治州农业科学院，吉林 龙井 133400)

茉莉酸甲酯对生物反应器培养高山红景天愈伤组织有效物质积累的影响

管 桐1, 李 贺1, 王洪秋1, 代 月2*

(1.延边大学农学院，吉林 延吉 133002；2.延边朝鲜族自治州农业科学院，吉林 龙井 133400)

为提高高山红景天愈伤组织中有效物质的积累，试验研究了茉莉酸甲酯(MeJA)的处理时间及浓度对生物反应器内培养的愈伤组织中有效物质含量及生产量的影响。结果表明：MeJA处理对愈伤组织中有效物质的积累有促进作用，在反应器培养20 d时,加入MeJA 175 μmol处理3 d最有利于红景天苷、酚类、多糖及黄酮含量的增加； MeJA 275 μmol处理，对红景天-苷、酚、多糖及黄酮等有效物质的积累效果最佳，其生产量分别为未处理的4.6、1.6、1.3和1.3倍。因此，利用生物反应器培养愈伤组织生产高山红景天有效物质时，可在培养第20天时加入275 μmol的MeJA处理3 d,可在短期内达到有效物质生产量最大化。

生物反应器；愈伤组织；有效物质；高山红景天

高山红景天(RhodiolasachalinensisA.Bor)是景天科红景天属植物[1-2]，又名库叶红景天，是长白山珍贵的药用植物之一[3-5]。具有多种且复杂的生物活性成分，主要包括鞣质、黄酮类化合物、酚类、红景天苷、多糖及微量发油等物质。红景天作为一种名贵的中草药，性凉，滋补元气[6]，其在补气、补血、清热、解毒、扶正、固本等方面药用疗效显著[7]，作为强壮剂[8]，具有抗缺氧、抗辐射、抗疲劳、抗病毒、抗抑郁、提高免疫力、促进内分泌等效果[9]，且对肿瘤的抑制及神经系统的调节也具有显著的疗效,同时对老年性心衰病症也有一定的防护作用。茉莉酸甲酯(MeJA)是在组织培养中被广泛应用的用于提高次生代谢产物积累的非生物诱导子，是通过刺激植物细胞而形成的一种抗毒素信号物质[10-11]。适当使用MeJA能够有效解决人工培养的愈伤组织中有效物质相比野生的高山红景天中含量低这一问题。研究显示，在水飞蓟愈伤组织培养中添加茉莉酸甲酯时，显著提高了水飞蓟素的积累[12]。在人参愈伤组织培养过程中单独添加200 μmol/L的茉莉酸甲酯能够有效的促进细胞中皂苷的积累[13]。因此，本试验研究MeJA对生物反应器内培养的高山红景天愈伤组织内生物活性物质的含量以及对DPPH自由基清除能力的影响，旨在为提高高山红景天内次生代谢产物提供新的方法与理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

参照邵春绘等[14]的方法诱导出高山红景天的愈伤组织。

JA2002电子天平(上海精天电子仪器有限公司)；YHW1103远红外快速干燥箱(天津市华北实验仪器有限公司)；LG16-B离心机(北京雷波尔离心机有限公司)；UV1102紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)。所有试剂均购于天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 茉莉酸甲酯处理天数对反应器内高山红景天愈伤组织生物量的影响

将鲜重20 g的愈伤组织接种到工作体积为2 L的3 L反应器中，培养基为MS+BA 3.0 mg/L+ NAA 0.3 mg/L+ 蔗糖30 g/L，pH值为5.8，将MeJA(175 μmol)在愈伤组织反应器培养至20 d时添加，处理时间分别设置为2、3、4、5、6、8和10 d。反应器通气量为0.1 vvm，以未加入诱导子的为对照组，培养相对应的天数后将愈伤组织取出，用自来水冲洗干净，沥干水分后称取鲜物重(FW)，然后分别放入标记好的培养皿中并置于45 ℃恒温烘干箱(YHW1103，天津市华北实验仪器有限公司，中国)中烘干至恒重后称量其干物重(DW)，并记录数据，收集烘干后的材料放入冰箱中,待测定红景天苷、酚类、多糖、黄酮含量。

1.2.2 茉莉酸甲酯处理浓度对反应器内高山红景天愈伤组织生物量的影响

将鲜重为20 g的愈伤组织接种到工作体积为2 L的3 L反应器中，培养基为MS+BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L，PH值为5.8。为筛选出适宜的MeJA浓度，将MeJA在愈伤组织反应器培养至20 d时添加，分别加入75，125，175，225，275，325 μmol的MeJA。反应器通气量为0.1 vvm，根据上述试验筛选出的MeJA最佳处理时间，以未加入诱导子的为对照组(0 μmol)，培养方式及材料收获方式同1.2.1。记录鲜物重、干物重后将烘干后的材料放入冰箱中,待测定红景天苷、酚类、多糖、黄酮含量。

1.2.3 抗氧化活性的测定

将鲜重为20 g的愈伤组织接种到工作体积为2 L的3 L反应器中，培养基为MS+BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+ 蔗糖30 g/L，pH值为5.8。在反应器培养愈伤组织20 d时，加入MeJA 275 μmol，以未经MeJA处理作为对照组，培养3 d后收获材料并烘干，培养方式及材料收获方式同1.2.1，收集干粉待用。

1.2.4 生物量的测定

将在反应器中培养25 d时收获的愈伤组织过筛，使之与培养基分离，然后用自来水冲洗2～3次后，用滤纸吸干愈伤组织表面上的水分，称取鲜物重。烘干后称取干物重，方法同1.2.1。

增殖系数= (收获时愈伤组织鲜物重/g-接种时愈伤组织鲜物重/g) /接种时愈伤组织鲜物g。

1.2.5 红景天苷含量的测定

红景天苷的提取与测定参考许剑锋[15]的方法。精确称取红景天愈伤组织的干燥粉末0.5 g于50 mL三角瓶中，并向其中加入10 mL甲醇进行溶解并摇匀，在125 W的超声波中进行超声提取，时间为30 min，再放入75 ℃的恒温水浴锅中加热5 h，待冷却后补充以上过程中缺失的甲醇至原质量。用0.22 μm的过滤器对上清液进行过滤，滤液保存至无光低温条件下，以备高效液相色谱检测。设置高效液相色谱检测波长为275 nm；流动相甲醇-水(85∶15)；流速1 mL/min；进样量10 μL；温度30 ℃；保留时间11.8 min。

1.2.6 多糖含量的测定

多糖的提取与含量的测定参考胡彦武[16]的方法。多糖的提取：称取愈伤组织干燥粉末0.2 g，加入适量的90%乙醇浸泡洗涤6 h，重复浸泡2次后将滤渣于通风橱中挥干，加入蒸馏水20 mL，在45 ℃条件下超声处理30 min，过滤，收集滤液，重复3次后合并滤液，并将滤液定容至100 mL，即得待测样品溶液。以苯酚-浓硫酸法在490 nm处测定葡萄糖的吸光值，计算愈伤组织中多糖的含量。

多糖含量/(mg/g)=(C·D·f)/W

式中,C为样品溶液中葡萄糖的浓度/(g/L)；D为样品溶液的稀释因素；f为换算因子；W为样品的质量/g。

1.2.7 黄酮含量的测定

参照改良的Chang等[17]有方法测定黄酮的含量。称取0.1 g干燥粉末于50 mL三角瓶中，加入10 mL 70 %乙醇，在60 ℃恒温水浴锅中加热3 h后取出，待液体冷却至室温后倒入离心管中，在转速为5 000 r/min、温度4 ℃下离心15 min，精密抽取上清液，定容至25 mL，取上述溶液1 mL稀释至5 mL(用蒸馏水稀释)。取1 mL该溶液为待测样品。按标准曲线步骤操作，测定吸光值，并计算愈伤组织中黄酮含量。

黄酮含量/(mg/g)=C·V·D × 10

式中,C为样品溶液浓度/(mg/mL)；V为样品溶液体积/mL；D为稀释倍数。

1.2.8 酚类含量的测定

参照改良的Singleton等[18]的方法测定总酚的含量，称取0.1 g干燥粉末于50 mL三角瓶中，加入10 mL 80%甲醇，在80 ℃恒温水浴锅中加热1 h后取出，待液体冷却至室温后倒入离心管中，在转速为5 000 r/min、温度为4 ℃下离心15 min，精密抽取上清液，定容至25 mL，取上述液体1 mL稀释至2 mL即为待测样品溶液(用蒸馏水稀释)。按标准曲线步骤操作，测定吸光值，并计算愈伤组织中酚含量。

酚含量/(mg/g)=C·V·D × 10

式中,C为样品溶液浓度/(mg/mL)；V为样品溶液体积/mL；D为稀释倍数。

1.2.9 抗氧化活性的测定

参考并改进Sarikurkcu[19]等的方法，称取20 mg DPPH并定容至500 mL容量瓶中，即得到0.1 mM DPPH溶液，避光保存待用。将0.05 g愈伤组织干粉定容至25 mL，即得浓度为2 mg/mL样品溶液，再分别将样品溶液稀释为0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/mL。分别取上述样品溶液和DPPH溶液各2 mL于试管中，均匀混合后室温避光静置30 min。设置2 mL甲醇+2 mL DPPH溶液作为空白对照组，在波长为517 nm处测定各组吸光值。

DPPH自由基清除率/(I %)=(Ai-Aj)/ Ai×100

式中,Ai为对照组；Aj为样品组。

1.2.10 数据整理及软件分析

利用SPSS11.5程序中的方差分析对试验数据进行分析，采用邓肯氏新复极差法进行比较，显著水平为0.05，每个处理3次重复。

2 结果与分析

2.1 茉莉酸甲酯处理天数对反应器内高山红景天愈伤组织生物量的影响

高山红景天愈伤组织在气升式生物反应器中培养20 d后，加入175 μmol的MeJA，分别处理0、2、3、4、5、6、8和10 d，结果发现加入MeJA 0～3 d时，愈伤组织的生物量均呈逐渐增加的趋势，在3 d时愈伤组织的鲜物重以及干物重均达到最大值，分别是298和11.7 g/L，而在4～10 d生物量呈下降趋势(图1)。

图1 茉莉酸甲酯处理天数对反应器内

由图2可知,在茉莉酸甲酯处理时间对有效物质含量影响的试验中，MeJA处理3 d时，红景天苷的含量和生产量达到最大值,为2.41和25.26 mg/L，之后随着处理天数的增加，红景天苷的含量和生产量均呈下降趋势；随着处理天数的增加多糖含量和生产量也呈上升趋势，在3 d时多糖含量达到最大值,为326.22 mg/g，而多糖生产量在MeJA处理6 d时达到最大值2.19 g/L；而酚含量和生产量则随着处理时间的增加整体呈下降趋势，在0～3 d缓慢下降，3 d后急剧下降，在6～10 d时趋于平缓；黄酮含量和生产量与酚有着相同的变化趋势，整体呈下降趋势，不同的是黄酮的生产量在MeJA处理8 d后仍处于下降趋势(图2)。由此得出结论，MeJA处理3 d最有利于高山红景天愈伤组织内有效物质的积累。

图2 茉莉酸甲酯处理天数对反应器内高山红景天愈伤组织中有效物质积累的影响

2.2 茉莉酸甲酯处理浓度对反应器内高山红景天愈伤组织生物量的影响

在愈伤组织培养20 d后，分别加入不同浓度的MeJA(0～325 μmol)处理3 d后发现，随着MeJA浓度的增加,高山红景天愈伤组织的鲜物重以及干物重均呈下降趋势(图3)。

经MeJA处理后的高山红景天愈伤组织，比未经MeJA处理组的颜色淡，但是生物量无明显差异(图4)。

图3 茉莉酸甲酯处理浓度对反应器内

图4 茉莉酸甲酯处理浓度对反应器内

愈伤组织中红景天苷含量和生产量均在MeJA浓度为275 μmol时达到最大值，分别为3.52和38.6 mg/L。酚含量和生产量与红景天苷有着相同变化趋势，在MeJA浓度为275 μmol时出现最大值,分别为6.88和72.8 mg/L。而黄酮含量和生产量总体趋势较为平缓，在MeJA浓度为275 μmol时达到最大值,分别为13.79和158.6 mg/L。多糖含量和生产量随着MeJA浓度的增加而增加，在MeJA浓度为275和325 μmol时无明显差异，均达到最大值。因此，MeJA浓度为275 μmol时，最有利于高山红景天内生物活性物质的积累且不影响愈伤组织的生长(图5)。

图5 茉莉酸甲酯处理浓度对反应器内高山红景天愈伤组织中有效物质积累的影响

2.3 抗氧化活性的测定

抗氧化活性的研究是采用DPPH自由基清除能力来评价。经过MeJA处理组(MeJA)和对照组(CK)的DPPH自由基清除能力的测试结果(图6)，随着样品浓度的升高，2组的清除能力也呈逐渐升高的趋势，其中,处理组IC50为0.45 mg/mL，对照组IC50则明显高于处理组，为0.7 mg/mL。因此，经过MeJA处理后的高山红景天愈伤组织的抗氧化能力明显增强，在某种程度上可以缓解自由基对机体造成的氧化损伤，能够起到对生物体的保护作用。

图6 茉莉酸甲酯处理和未处理的

3 讨论与结论

在植物生长发育过程和应对外界不良环境时，植物体内能产生一种次生代谢产物来抵御外干扰，以达到植物体本身新陈代谢的平衡。在植物组织培养工程中，利用诱导子提高药用植物体内代谢产物的产量是一个行之有效的被广泛应用的方法。其中，MeJA被认为是一种内源信号分子，能够激活植物次生代谢机制过程中相关途径间酶的活性，能够有效提高植物组织、细胞以及器官中次生代谢产物的合成，目前是药用植物细胞培养中常用的方法。研究表明，在组织培养过程中添加MeJA作为诱导子，对提高有效物质的含量有显著的效果。于丹[20]在筛选MeJA处理时间对反应器内培养东北刺人参不定根中活性物质积累的试验中发现，MeJA处理第8 d时，其多糖、酚、黄酮含量达到最大值；段永波[21]等在半夏悬浮细胞培养21 d时，用150 μmol/L MeJA处理后生物碱含量是未处理组的3.6倍，且sAMP合成酶活力是对照组的2.6倍。由此可见，诱导子的添加对提高生物反应器内培养的药用植物组织或细胞中有效物质含量具有重要意义，且诱导子处理时间以及处理浓度的不同对有效物质的积累影响有所不同。本试验中，在MeJA处理3 d时，红景天苷的含量和生产量达到最大值，分别为2.41和25.26 mg/L。同时，MeJA浓度为275 μmol时，最有利于高山红景天内生物有效物质的积累。本研究采用了DPPH自由基清除能力对高山红景天愈伤组织的抗氧化能力进行评价，结果表明，经过MeJA处理后高山红景天愈伤组织的抗氧化活性明显得到提升，而愈伤组织内起到抗氧化作用的物质可能为黄酮和多糖，二者均为植物体内具有抗氧化[22-23]、抗病毒、抗癌的天然活性物质，被许多学者从植物中提取出来并得到广泛应用[24-27]，但对于高山红景天愈伤组织内起抗氧化作用的主要物质还有待于做进一步的讨论与研究。

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Effect of Methy Jasmonate (MeJA) on effective compound accumulation ofRhodiolasachalinensisduring callus bioreactor culture

GUAN Tong1, LI He1, WANG Hongqiu1, DAI Yue2*

(1.AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China;2.AcademyofAgriculturalSciencesofYanbian,LongjingJilin133400,China)

In order to enhance effective compound accumulation of Rhodiola sachalinensis during callus bioreactor culture, the effects of concentration and treatment days of Methy Jasmonate (MeJA) on effective compound accumulation were studied. The results showed that the effect of treatment days of MeJA had a great influence on effective compound accumulation in callus with increase of salidroside, phenol, flavonoid and polysaccharides contents. The bioreactor compound accumulation was promoted when the medium was supplemented with MeJA 175 μmol after 20 days of bioreactor culture and the optimal treatment days was 3 d. The maximum productivities of effective compound (salidroside, phenol, flavonoid and polysaccharides) were measured maximum value at 275 μmol MeJA. Their levels were 4.6, 1.6, 1.3 and 1.3-fold greater than control. During bioreactor culture ofRhodiolasachalinensiseffective compound, adding 275 μmol MeJA in medium to induce 3 days could maximized the production of effective compound in short time. The present study could provide a reference for commercialization and development ofRhodiolasachalinensisproduction.

bioreactor; callus; effective compound;Rhodiolasachalinensis

2017-01-06 基金项目:国家自然科学基金项目(81160497)

管桐(1994—)，女，吉林和龙人，在读硕士，研究方向为植物组织培养及生物反应器的应用。代月为通信作者，E-mail: mllian@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)01-0023-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.01.004

S567.239

A