SM-1对人肝微粒体细胞色素P450亚型酶的抑制作用

陈燕芬，陈景秀，孙 萌，丁俊垚，程泽能，胡高云，丁劲松，朱曲波

(中南大学湘雅药学院，湖南 长沙 410013)

SM-1对人肝微粒体细胞色素P450亚型酶的抑制作用

陈燕芬，陈景秀，孙 萌，丁俊垚，程泽能，胡高云，丁劲松，朱曲波

(中南大学湘雅药学院，湖南 长沙 410013)

目的 观察SM-1对人肝细胞色素P450酶系统中7种亚型酶活性的影响。方法 在体外将一定浓度的底物或SM-1与人肝微粒体孵育30 min，分为对照组(底物)和实验组(底物和SM-1)，以非那西丁、安非他酮、紫杉醇、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、右美沙芬、睾酮为CYP探针底物，应用HPLC法检测各探针底物代谢量，计算抑制率，评价SM-1对人肝微粒体CYP1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、3A4 酶的抑制活性。结果 SM-1对CYP1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、3A4的抑制率分别是0.05%、3.37%、0.08%、2.07%、4.20%、-0.15%和10.84%。结论 SM-1对CYP3A4可能有抑制作用，临床用药时应注意因CYP酶抑制引起的药物相互作用。

SM-1；细胞色素P450；底物；抑制率；肝微粒体；亚型酶

SM-1是根据PAC-1的构效关系，将其主要的药效基团哌嗪环改为高哌嗪环而新合成的小分子化合物。化学结构式为[4-苄基-(1,4)二氮杂环庚烷-1-基]-乙酰(3-烯丙基-2-羟基-亚甲基苯)肼富马酸盐[1]。SM-1能特异性激活肿瘤细胞procaspase-3成为caspase-3，从而导致肿瘤细胞的快速死亡，而其对正常细胞活性影响小，是一种新型的非细胞毒特异性的抗肿瘤药物[2]。

细胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP450)是一个参与临床药物代谢的重要代谢酶系。近年来，中西药间、西药之间以及中药复方的有效成分之间，基于细胞色素P450酶的诱导和抑制的作用，引起了很多临床医生和药理学家的关注，也成为新药开发的一个重要研究方向[3-6]。某一个药物对CYP450 酶的诱导或者抑制，会影响合用药物的药代动力学，同服用的其他药物的代谢可能被改变，这是引起药物相互作用的一个重要因素[7-10]，进而会影响临床用药的安全性和有效性。值得注意的是，目前仍然没有SM-1对CYP酶抑制活性的系统性研究。本文在人肝微粒体(human liver microsomes,HLM)的孵育体系中，系统评价了SM-1对CYP同工酶的抑制作用，为SM-1临床前研究提供参考的实验资料和科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 SM-1(广州南新药业有限公司，含量≥99.40%，批号：15060101)、非那西丁(阿拉丁有限公司，含量≥98.0%，批号：H1428073)、安非他酮(上海毕得医药科技有限公司，含量>97.0%，批号：BD118984)、紫杉醇(美仑生物有限公司，含量>99.0%，批号：A0820A)、奥美拉唑(美仑生物有限公司，含量>99.0%，批号：20131005)、右美沙芬(南京森贝伽生物科技有限公司，含量>98.0%)、睾酮(上海源叶生物科技有限公司，含量>98.0%，批号：LM0514TA14)。人肝微粒体(BD公司，批号：5168001)、NADPH再生体系(Sigma公司，批号：1002065816)。色谱纯乙腈和甲醇(美国默克公司)、纯水(实验室自制去离子水)。Agilent 1200型高效液相色谱仪(Agilent，德国)，配有色谱柱Agilent C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、数显测速恒温摇床SHA-B(苏州威尔实验用品有限公司)。

1.2 肝微粒体孵育实验 实验分组为：CYP酶探针底物、CYP酶探针底物+阳性抑制剂、CYP酶探针底物+受试药、阴性对照组。孵育体系是200 μL，包括0.5 mmol·L-1K2HPO4/ KH2PO4缓冲溶液(pH 7.4)，含有1 mmol·L-1NADPH、HLM(蛋白含量0.5 g·L-1)、CYP酶探针底物、不同浓度的阳性抑制剂或受试药。在各探针底物Km范围内选择孵育的浓度:非那西丁(10 μmol·L-1)、安非他酮(100 μmol·L-1)、紫杉醇(10 μmol·L-1)、甲苯磺丁脲(100 μmol·L-1)、奥美拉唑(20 μmol·L-1)、右美沙芬(5 μmol·L-1)和睾酮(55 μmol·L-1)。通过检测特异性反应的底物代谢量，评价各个CYP同工酶的活性。

将缓冲溶液、人肝微粒体、探针底物和受试药混匀，37℃水浴预孵5 min，加入NADPH(预孵5 min)启动反应，37℃水浴孵育30 min后，冰上冷却，并加入100 μL的预冷甲醇终止反应，涡旋，15 700×g，4℃离心10 min，取上清进样分析，测定底物代谢量，计算相对酶活性。

1.3 底物的HPLC定量分析 本实验室已经建立HPLC方法定量检测相应的7个探针底物。① 非那西丁、奥美拉唑、睾酮检测条件如下：流动相为乙腈-水(45/55，V/V)；流速为1.0 mL·min-1；进样体积为20 μL；柱温为25℃；检测波长为245 nm。② 安非他酮检测条件如下：流动相为乙腈-磷酸氢二钾(0.01 mol·L-1，pH为7.4)(60/40，V/V)；流速为1.0 mL·min-1；进样体积为20 μL；柱温为25℃；检测波长为248 nm。③ 紫杉醇检测条件如下：流动相为甲醇-水(60～70/25 min，V/V)；流速为1.0 mL·min-1；进样体积为20 μL；柱温为45℃；检测波长为230 nm。④ 甲苯磺丁脲检测条件如下：流动相为乙腈-磷酸二氢铵(0.01 mol·L-1，pH为3.5)(40/60，V/V)；流速为1.0 mL·min-1；进样体积为20 μL；柱温为25℃；检测波长为254 nm。⑤ 右美沙芬检测条件如下：流动相为乙腈-磷酸氢二钠(0.01 mol·L-1，pH为3.0)(40/60，V/V)；流速为1.0 mL·min-1；进样体积为100 μL；柱温为25℃；检测波长为278 nm。

2 结果

2.1 肝微粒体孵育体系的验证 应用睾酮作为肝微粒体经典底物进行代谢，验证肝孵育体系。从肝微粒体检测结果可知，睾酮在人微粒体体外孵育体系中代谢30 min后，代谢率达63.28%，睾酮代谢率稳定(Tab 1)，微粒体体外孵育体系活性良好，可用于实验研究。

Tab 1 Metabolism rate of testosterone

2.2 SM-1对人肝微粒体中的CYP同工酶抑制作用 在本研究中SM-1应用的抑制浓度(3 mg·L-1) ，SM-1对HLM中7种CYP同工酶代谢的抑制率见Tab 2。在检测SM-1对人肝微粒体CYP经典底物的抑制情况时，对CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4的抑制率分别是0.05%、3.37%、0.08%、2.07%、4.20%、-0.15%、10.84%，提示SM-1对CYP3A4可能有抑制作用。

Tab 2 The inhibition rate of SM-1 on each subtype enzyme substrate

3 讨论

本实验在体外的人肝微粒体孵育体系中，探针底物选用了美国FDA推荐的种类和浓度，系统性评价了SM-1对于7种比较常见CYP同工酶的抑制作用，通过单点峰面积法定量地评价了SM-1对CYP酶的抑制活性。由于CYP1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、3A4 7种亚型酶介导了90%以上的临床药物生物转化，是作为基于CYP酶药物相互作用的研究重点[11]。因为CYP各个亚型同工酶会参与不同的代谢反应，因此，CYP酶介导的代谢和生成的代谢产物种类或量都存在着一些差异[12]。在本次实验中，为了减少受试药物和7种不同探针底物的相互干扰作用，采取了7种不同的色谱条件。CYP2D6和CYP3A4是具有重要意义的CYP450药物代谢酶，参与了临床上多种常用药物的代谢。而SM-1可能会对CYP2D6和CYP3A4有抑制作用，因此在临床上，SM-1和经CYP2D6和CYP3A4代谢的底物合用时,应该注意避免药物相互作用的发生,避免SM-1使这些底物的代谢减少，底物血药浓度增加，增强药物的毒副作用，甚至造成生命危险。

(致谢：本项工作主要在中南大学湘雅医学院与湖南省泰格湘雅制药共同完成，在此表示感谢。)

[1] 唐 靖, 罗丽娜, 张海龙，等.基于procaspase-3激活的抗肿瘤活性分子SM-1吸收机制研究[J].中国药理学通报,2014，30(4):542-6.

[1] Tang J, Luo L N, Zhang H L,et al.Absorption mechanism of SM-1: a procaspase-3-activated anti-tumor agent[J].ChinPharmacolBull, 2014，30(4): 542-6.

[2] Chen Y, Sun M, Ding J, et al.SM-1, a novel PAC-1 derivative, activates procaspase-3 and causes cancer cell apoptosis[J].CancerChemotherPharmacol, 2016, 78(3): 643-54.

[3] 杨晓燕, 叶 静, 孙桂霞，等.表小檗碱体外大鼠肝微粒体孵育代谢产物鉴定及对CYP2D6酶活性的抑制作用[J].中国中药杂志, 2014，39(19): 3855-9.

[3] Yang X Y, Ye J, Sun G X,et al. Identification of metabolites of epiberberine in rat liver microsomes and its inhibiting effects on CYP2D6[J].ChinaJChinMaterMed, 2014，39(19): 3855-9.

[4] 颜晶晶, 俸 珊, 何丽娜，等.延胡索乙素对映体对人肝微粒体细胞色素P450酶抑制作用机制研究[J].中草药, 2015，46(4): 534-40.

[4] Yan J J ,Feng S, He L N,et al. Inhibitory mechanism of tetrahydropalmatine enantiomers on cytochrome P450 in human liver microsomes[J].ChinTraditHerbDrugs, 2015，46(4): 534-40.

[5] 周 璐, 徐婷婷, 金若敏，等.吴茱萸水煎液对大、小鼠肝药酶亚型影响的比较研究[J].中国药理学通报, 2014, 30(2): 279-82.

[5] Zhou L, Xu T T, Jin R M,et al. A comparative study of effect ofEuodiaeFructusdecoction on activity of drug-metabolism enzymes in rat and mouse live microsome[J].ChinPharmacolBull, 2014, 30(2): 279-82.

[6] 马增春, 梁 淼, 赵佳伟，等.四物汤及其有效成分对大鼠肝脏主要药物代谢酶的影响[J].中国药理学通报, 2015，31(9): 1319-23.

[6] Ma Z C, Liang M, Zhao J W,et al. Effects of Si-Wu Decoction and its active components on cytochrome P450 in rats[J].ChinPharmacolBull, 2015，31(9): 1319-23.

[7] Zielinski J, Mevissen M.Inhibition ofinvitrometabolism of testosterone in human, dog and horse liver microsomes to investigate species differences[J].ToxicolInVitro, 2015, 29(3): 468-78.

[8] 徐 斌, 赵 刚, 位 华，等.20味中成药对5个人肝微粒体酶活性的影响[J].药学实践杂志, 2009, 27(5): 353-6.

[8] Xu B, Zhao G, Wei H,et al.Effects of 20 Chinese patent medicines on the catalytic activities of five main cytochrome P450s of human liver microsome[J].JPharmPract, 2009, 27(5): 353-6.

[9] Korobkova E A.Effect of natural polyphenols on CYP metabolism: implications for diseases[J].ChemResToxicol, 2015, 28(7): 1359-90.

[10]张红曦, 王宇光, 马增春，等.参麦注射液对大鼠心脏细胞色素P450酶的调节作用[J].中国药理学通报, 2014,30(4): 484-90.

[10]Zhang H X, Wang Y G, Ma Z C,et al. Effects of Shenmai injection on the regulation of heart CYP450 isozymes in rats[J].ChinPharmacolBull, 2014,30(4): 484-90.

[11]Fowler S, Zhang H.Invitroevaluation of reversible and irreversible cytochrome P450 inhibition: current status on methodologies and their utility for predicting drug-drug interactions[J].AAPSJ, 2008, 10(2): 410-24.

[12]焦士勇, 艾常虹, 李艾芳,等.补骨脂酚的体外肝微粒体代谢及代谢减毒作用的种属比较[J].中国药理学通报, 2011,27(2): 216-20.

[12]Jiao S Y, Ai C H, Li A F,et al.Invitrointer-species comparison of metabolism and metabolic detoxification of bakuchiol in liver microsomes[J].ChinPharmacolBull, 2011,27(2): 216-20.

Inhibitory effect of SM-1 on human liver microsomal cytochrome P450 enzyme

CHEN Yan-fen,CHEN Jing-xiu, SUN Meng, DING Jun-yao, CHENG Ze-neng, HU Gao-yun, DING Jin-song,ZHU Qu-bo
(SchoolofPharmaceuticalSciencesinCentralSouthUniversity,Changsha410013,China)

Aim To investigate the effect of SM-1 on seven main cytochrome P450(CYP450) in human liver microsomes.Methods Substrate or SM-1 was incubated with human liver microsomes for 30 mininvitro, and divided into control group and experimental group. The effects of SM-1 on the main phase I metabolic enzymes in human liver microsomes was detected by HPLC. Phenacetin, bupropion, paclitaxel, tolbutamide, omeprazole, dextromethorphan, testosterone were investigated as probe drugs.Results Inhibition rate of SM-1 on the classical substrate of human liver microsomal CYP was 0.05%,3.37%,0.08%,2.07%,4.20%,-0.15% and 10.84%, respectively.Conclusions SM-1 may have inhibitory effect on CYP3A4.Attention should be paid to the interaction of clinical drug induced by CYP enzyme inhibition.

SM-1;cytochrome P450；substrate；inhibition rate；microsomes；subtypes of enzymes

2016-12-02,

2017-01-04

国家科技部“重大新药创新与发展”重大专项项目(No 2012ZX09103101-051)；基础研究中国中央大学资助项目(No 7601110179)；中南大学研究生自主探索创新基金(No 2016zzts494)

陈燕芬(1991-)，女，硕士生，研究方向：临床前药动学，E-mail: 852605755@qq.com; 程泽能(1965-)，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：药物代谢机制，通讯作者，E-mail: chengzn@csu.edu.cn; 朱曲波(1981-)，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：microRNA在癌症中以及眼科疾病中的作用以及药物胃肠道转运，通讯作者，E-mail: biqbz@hotmail.com

时间：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.016.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.008

A

1001-1978(2017)05-0627-03

R322.47；R345.99；R977.3；R979.1