缺血性脑血管病细胞自噬相关因子与斑块炎性反应的相关性

朱应斌，项廷杰，林 杰

(文成县人民医院 内二科，浙江 文成 325300)

健康科学临床研究

缺血性脑血管病细胞自噬相关因子与斑块炎性反应的相关性

朱应斌，项廷杰，林 杰

(文成县人民医院 内二科，浙江 文成 325300)

目的 探讨缺血性脑血管患者细胞自噬相关因子与炎性因子的相关性，为完善其病理机制，寻找新的治疗靶点提供依据。方法 选取缺血性脑血管病患者85例，按照颈动脉斑块分级分为三组：Ⅰ级21例、Ⅱ级35例、Ⅲ级29例，并以33例健康志愿者为对照组。抽取空腹肘静脉血，采用WB法测定自噬相关因子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ与Beclin-1的蛋白表达量，采用ELISA法测定炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平。结果 对照组、Ⅰ级斑块、Ⅱ级斑块、Ⅲ级斑块的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1表达和血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平依次升高(P<0.05)；经Pearson分析，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达与IL-1β、IL-6和TNF-α水平之间，Beclin1表达与IL-1β、IL-6和TNF-α水平之间均呈线性正相关(P<0.05)；经秩相关分析，颈动脉斑块分级与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、IL-1β、IL-6、TNF-α之间均呈正相关性(P<0.05)。结论 缺血性脑血管病患者细胞自噬能够通过与炎性反应的相互作用影响斑块稳定性，可能为其病理机制的重要组成部分。

缺血性脑血管；细胞自噬；斑块；炎性因子

缺血性脑血管病指脑部血液循环障碍所致脑组织缺血、缺氧性损伤，严重者可致神经功能缺损或脑梗死。解剖学研究表明[1]，大脑中动脉是颈内动脉的延续，脑组织的血供主要来自于颈内动脉，正因如此，颈动脉粥样硬化是缺血性脑血管的重要病理学基础之一，约有20%～30%的缺血性脑血管病直接与颈动脉粥样硬化有关。其中颈动脉斑块破裂脱落的栓子是造成该病急性发作的重要原因，现有研究已证实[2]，斑块稳定性与炎性反应有关，IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子水平与斑块危险程度分级具有正相关性。细胞自噬在血管病中发挥的作用近几年才受到重视，并被证实与炎性损伤有关[3]。本研究分析缺血性脑血管病患者细胞自噬与斑块炎性反应之间的关系，以期进一步完善缺血性脑血管病的病理机制，为寻找新的治疗靶点提供依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取本院 2014年9月-2016 年9月收治的缺血性脑血管病患者85例，纳入标准：①符合全国第四届脑血管病学术会议修订的脑梗死或短暂性脑缺血诊断标准、同时符合动脉粥样硬化诊断标准；②年龄≤80岁；③签署知情同意书。排除标准：①颅内出血或感染；②脑外伤；③认知功能或意识障碍；④肿瘤或癌症；⑤风湿性关节炎、糖尿病等其他能引发全身炎性症状的疾病；⑥近6个月免疫类、激素类药物使用史；⑦近1个月抗凝治疗史。本组男44例、女41例，年龄44～79岁，平均63.5±10.9岁；体质量指数19.4～32.7kg/m2，平均23.1±9.8kg/m2。另以同期入院体检的33例健康人群为对照，其中男19例、女14例，年龄44～79岁，体质量指数21.7～30.6kg/m2，平均22.6±8.3kg/m2。两组患者年龄、性别和体质量指数差异无统计学意义(P<0.05)。

1.2 颈动脉斑块分级方法 取颈总动脉分叉处近端后壁1.5 cm处，采用SSI-3000彩色多普勒超声仪测定颈动脉内膜中层厚度(intima-media thickness，IMT)，测定位置，以双侧均值为患者IMT。参照华盛顿大学颈动脉粥样硬化斑块的超声分级标准[4]，1.3mm<双侧斑块<2 mm为Ⅰ级，1.3mm<单侧斑块<2 mm为Ⅱ级，双侧斑块≥2 mm为Ⅲ级。

1.3 细胞自噬相关因子测定方法 所有研究对象，均于治疗前取清晨空腹肘静脉血，进行免疫蛋白印迹(western blotting，WB)实验。主要步骤：(1)蛋白提取和溶液配置：采用全血蛋白质抽提试剂盒(HR0089，北京百奥莱博科技有限公司)提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，并配置成10μg/μL的Buffer溶液。(2)电泳与转印：以1μL/通道的上样量进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel，SDS-PAGE)电泳，40V预电泳30min后调至90V电泳90min。经电泳，分子量不一致的蛋白分离成单条带，丽春红染液漂洗观察条带分离状态，分离清晰者转印至硝化纤维素(nitrocellulose，NC)膜。(3)抗体孵育：将所得NC膜封至一抗溶液孵育，4 ℃过夜。抗体均购自Abcam，微管关联蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)抗体(ab51520)，可同时显示LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ两条条带，使用浓度为1∶2000～1∶1500；Beclin1一抗(ab62557)，使用浓度1∶2500～1∶1500；β-Actin一抗(ab8227)使用浓度1∶3000。孵育完毕后PBS清洗，二抗孵育，37 ℃ 90min，所有指标共用一个二抗(ab190466)，使用浓度1∶2000。(4)显影与测量，暗室操作，获得的X线胶片入图像分析软件扫描，分析灰度值，以所观察指标的灰度值与β-Actin的灰度值之比作为该指标的相对表达量。

1.4 炎性因子水平测定所有研究对象，均于治疗前取清晨空腹肘静脉血，常温静置40～60min，离心取血清，采用全自动生化分析仪和ELISA试剂盒检测血清炎性因子白细胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)的血清水平。ELISA试剂盒均购自上海恒远生物技术发展有限公司，检测原理均为双抗夹心法。

2 结 果

2.1 细胞自噬相关因子水平 各组患者的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1表达水平差异有统计学意义(P<0.05)；经LSD-t检验，对照组、Ⅰ级斑块、Ⅱ级斑块、Ⅲ级斑块的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1蛋白表达量依次升高，且组与组之间的差异均有统计学意义(P<0.05)；见表1、图1。

表1 各组患者外周血细胞自噬相关因子 水平比较

注：与上一组比较，*P<0.05；下同。

1：对照组；2：Ⅰ级级斑块；3：Ⅱ级级斑块；4：Ⅲ级斑块 图1 各组患者WB实验图片

2.2 炎性因子水平 各组患者的血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平差异有统计学意义(P<0.05)；经LSD-t检验，对照组、Ⅰ级斑块、Ⅱ级斑块、Ⅲ级斑块的IL-1β、IL-6和TNF-α水平依次升高，且组与组之间的差异均有统计学意义(P<0.05)；见表2。

表2 各组患者外周血清炎性因子水平比较±s)

2.3 相关性分析 经Pearson分析，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ与IL-1β、IL-6和TNF-α之间，Beclin1与IL-1β、IL-6和TNF-α之间均呈线性正相关(P<0.05，表3)；经秩相关分析，颈动脉斑块分级与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(Rs=0.722)、IL-1β(Rs=0.685)、IL-6(Rs=0.574)、TNF-α(Rs=0.774)之间均呈正相关性(均P<0.05)。

表3 缺血性脑血管病患者自噬相关因子与 炎性因子的相关系数

3 讨 论

炎症是引起内皮功能异常的常见机制，在缺血性脑血管病中，炎症与斑块的形成与发展密切相关。炎症因子是由各种免疫细胞及血管内皮细胞、成纤维细胞等部分非免疫细胞合成、分泌的一类小分子蛋白，生物学活性广泛，不仅仅涉及到免疫应答和炎性反应，还参与造血功能和组织修复[5]。生理条件下，内皮细胞分泌适量的炎性因子可抵抗病原体入侵和促进组织修复，在动脉粥样硬化中，往往存在过度炎性反应，炎性因子大量分泌，引发瀑布级联反应，导致内皮细胞损伤和凋亡，沉积于血管内壁，促进斑块的形成与发展。

细胞自噬属于Ⅱ型程序性细胞死亡，其生理功能在于降解和消化受损细胞器、多余蛋白质或入侵病原体，从而获得氨基酸、核酸、ATP等营养和能量，以供机体在严峻的生存条件下得以生存。因此，正常生理情况下，细胞自噬是一种自我保护机制，在动脉粥样硬化也是如此，细胞自噬通过抵御脂质过氧化应激和炎性应激等不利条件，及时清除异物，以防斑块破裂和脱落，有学者指出[6]，在进行性损害的纤维帽中，平滑肌细胞自噬可能是动脉粥样硬化患者维持斑块稳定性的最重要机制。然而，随着病情进展，细胞自噬脱离基础水平，转化为过度激活，则可能导致平滑肌细胞和内皮细胞的程序性死亡。研究表明[7-8]，细胞自噬引起的细胞死亡还能导致诸多促炎因子释放，促进炎性反应。当前研究已证实[9]，IL-1β、IL-6、TNT-α不仅是与细胞自噬密切相关的炎性因子，还是动脉粥样硬化中衡量斑块稳定性的重要标志物。

目前，国内对缺血性血管病细胞自噬和炎性因子的相关性研究较少，本研究对两者相关性的考察结果显示，对照组、Ⅰ级斑块、Ⅱ级斑块、Ⅲ级斑块的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1表达依次升高，且组与组之间的差异均有统计学意义，血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平的组间变化趋势与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1表达一致。进一步的Pearson分析发现LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达与IL-1β、IL-6和TNF-α水平之间，Beclin1表达与IL-1β、IL-6和TNF-α水平之间均呈线性正相关。在细胞自噬方面，本研究选取了LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ与Beclin1这两个指标，其中LC3 是第一个被发现的自噬体标记蛋白，存在Ⅰ和Ⅱ两种可以相互转化的形式，LC3-Ⅰ为可溶性，存在于胞浆，不发挥自噬活性；当自噬被激活后，LC3-Ⅰ经泛素化加工修饰转化为LC3-Ⅱ，结合于胞内自噬体膜，发挥自噬活性，因此LC3-Ⅱ或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均能够衡量LC3的活性状态[10]。WB实验所取抗体能同时显示Ⅰ和Ⅱ两条条带，故本研究直接以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ衡量LC3的活跃程度。Beclin1是自噬体形成过程中的必需物质，具有高度特异性，其水平升高能够反应自噬体形成数量的增加[11]。因此，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1的组间差异说明随着缺血性脑血管病斑块的产生和发展，细胞自噬活性也依次升高，这与国内学者任博等研究结果基本一致[12]。在炎性因子方面，本研究选取了IL-1β、IL-6、TNT-α三个指标，三者均为多功能促炎因子，其中IL-1β同时具有促炎和促凝作用，在神经细胞发生缺血性损伤时，其过量升高不仅能促进炎性损伤，还能够导致血栓形成。IL-6和TNF-α对神经组织和造血系统具有广泛效应，除了免疫细胞以外，室管膜细胞、血管内皮细胞、小神经胶质细胞及神经元等均能合成、分泌IL-6和TNF-α，因此两者在脑血管病种的研究较多。现有研究也已证实[13]，两者与动脉粥样硬化斑块的稳定性具有确切的相关性，本研究结果得出了相仿的结果。除此之外，本研究还证实，患者细胞自噬与炎性反应之间存在相互作用，可能为其病理机制的重要组成部分，其具体的作用关系还有待进一步研究加以证实。

综上所述，缺血性脑血管病患者斑块稳定性同时受到细胞自噬和炎性反应的影响，且细胞自噬与炎性反应之间存在相互作用，可能为其病理机制的重要组成部分。

[1]刘宏斌.缺血性脑血管病患者颈动脉粥样硬化斑块分布特点及预后[J].中国老年学杂志,2012,32(14):3089-3090.

[2]李秀丽,李宝丽.颈动脉斑块与脑梗死分型的相关性分析[J].医学综述,2013,16(13):2441-2443.

[3]秦德友,康俊玲,程超,等.急性脑梗死患者血清IL-6、IL-8、CRP水平变化及临床意义[J].中国医学前沿杂志(电子版),2014,6(3):39-42.

[4]林华扬,惠品晶,邢瑛琦.中国脑卒中血管超声检查指导规范[J].中华医学超声杂志(电子版),2015,12(8):599-610.

[5]黄家俊,杜林,汪永强,等.脑梗死患者颈动脉斑块与炎性因子的相关性研究[J].中国实用神经疾病杂志,2016,19(14):6-8.

[6]Xiong Y, Yepuri G, Forbiteh M,etal. ARG2 impairs endothelial autophagy through regulation of MTOR and PRKAA/AMPK signaling in advanced atherosclerosis [J]. Autophagy,2014,10(12):2223-2238.

[7] Sergin I, Razani B. Self-eating in the Plaque: What Macrophage Autophagy Reveals About Atherosclerosis [J]. TEM,2014,25(5):225-234.

[8] Vindis C. Autophagy: an emerging therapeutic target in vascular diseases [J]. British Journal of Pharmacology,2015,172(9):2167-2178.

[9] Maiuri MC, Grassia G, Platt AM,etal. Macrophage Autophagy in Atherosclerosis [J]. Mediators of Inflammation,2013,2013:584715.

[10] Tanaka T, Narazaki M, Kishimoto T. IL-6 in Inflammation, Immunity, and Disease [J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology,2014,6(10):a016295.

[11] Gurkar AU, Chu K, Raj L,etal. Identification of ROCK1 kinase as a critical regulator of Beclin1 mediated autophagy during metabolic stress [J]. Nature communications,2013,4:2189.

[12]任博,李琳,唐延军.缺血性脑血管病自噬与颈动脉斑块的相关性[J].中国动脉硬化杂志,2016,24(3):261-264+269.

[13]Mei Y, Thompson MD, Cohen RA,etal. Autophagy and oxidative stress in cardiovascular diseases [J]. Biochimica et biophysica acta,2015,1852(2):243-251.

Correlation of autophagy related factors to plaque inflammatory reaction in patients with ischemic cerebrovascular diseases

ZHU Ying-bin，XIANG Ting-jie，LIN Jie

(TheSecondDepartmentofMedicine,thePeople’sHospitalofWenchengCounty,Wencheng325300，China)

Objective To understand the correlation of autophagy related factors and plaque inflammatory reaction in patients with ischemic cerebrovascular diseases so as to obtain scientific knowledge for the development of a more effective method for treating the diseases. Method 85 patients with ischemic cerebrovascular disease were firstly chosen as the subjects of study and divided into 3 groups according to carotid plague degree: Degree 1 (n=21), Degree 2 (n=35), Degree 3 (n=29), and then 33 healthy volunteers were chosen as the control group. The fasting venous blood was extracted to detect LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and Beclin 1 expression by WB assay, and to detect serum levels of IL-1β、IL-6 and TNF-α by ELISA assay. Findings There was significant difference in LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰand Beclin 1 expression, and serum IL-1β, IL-6, TNF-α levels (P<0.05). The LSD-t test results showed that all the indexes increased in the control group and the experimental groups, namely, Degree 1, Degree 2, and Degree 3. There was significant difference between the groups (P<0.05). The Pearson analysis results showed that both LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ expression and Beclin1 expression had linear positive correlation with serum IL-1β, IL-6, TNF-α levels (P<0.05). Conclusion In ischemic cerebrovascular diseases, autophagy related factors influence plaque stability by interacting with inflammatory reaction factors, which may be an important component of the pathomechanism.

ischemic cerebrovascular disease; autophagy; plaque; inflammatory factor

2016-10-20

文成县科技局项目(2016041)

朱应斌(1959-)，男，浙江文成人，大专，副主任医师。

10.3969/j.issn.1674-6449.2017.02.010

R540.4

A

1674-6449(2017)02-0150-04