新疆一枝蒿cDNA文库构建方法研究Δ

刘 冲，程 波，何 江，杨伟俊，地力努尔·吐尔逊江，满尔哈巴·海如拉，薛桂蓬，魏梅梅，王 雪（新疆维吾尔自治区药物研究所/新疆维吾尔药重点实验室，乌鲁木齐 830004）

新疆一枝蒿cDNA文库构建方法研究Δ

刘 冲＊，程 波，何 江，杨伟俊#，地力努尔·吐尔逊江，满尔哈巴·海如拉，薛桂蓬，魏梅梅，王 雪（新疆维吾尔自治区药物研究所/新疆维吾尔药重点实验室，乌鲁木齐 830004）

目的：建立构建新疆一枝蒿cDNA文库的方法。方法：采用改良Trizol法提取一枝蒿幼嫩叶片总RNA，反转录成单链cDNA，长距离聚合酶链反应法（LD-PCR）合成双链cDNA；PCR产物经蛋白酶K消化，采用sfiⅠ酶切，酶切产物用CHROMA SPIN-400柱分级分离，回收0.4 kb以上的cDNA，以λTriplE×2噬菌体连接并进行体外蛋白包装，利用SMART技术构建一枝蒿全长cDNA文库；随机挑取文库中20个单克隆，电泳法测定原始文库滴度、文库容量、cDNA插入片段的重组阳性率与大小。结果：原始文库滴度为1.94×107pfu/m L，库容量为0.97×107pfu；cDNA插入片段重组阳性率为96%，大小为0.5～2.0 kb，平均为0.9 kb。结论：所构建的高库容、高质量的文库可为新疆一枝蒿cDNA文库的构建提供基础。

新疆；一枝蒿；cDNA文库；构建；功能基因

新疆一枝蒿（Artemisia rupestris L.）为菊科蒿属多年生草本植物，主要分布于我国新疆，其地上全草是新疆哈萨克医学常用药材。一枝蒿疗效确切、应用广泛，具有清热解毒、消食健胃、祛风凉血之功效，常用于治疗感冒、过敏、食积、蛇伤、疮疖[1]。民间谚语中记载着“家有一枝蒿，不怕被蛇咬；家有一枝蒿，百病都除掉”[2]。

目前，一枝蒿主要依靠自然繁殖生长，加上无计划地采挖和过度放牧，其野生资源面临枯竭。而且一枝蒿有效成分酮酸类化合物结构复杂，人工合成困难。如何使该药用资源可持续发展具有现实意义，而构建cDNA文库是探索药材相关功能基因组学的重要手段。文献报道已经成功构建了人参[3]、丹参[4]、铁皮石斛[5]、甘草[6]、滇重楼[7]等药用植物的cDNA文库。因此，在本研究中，笔者以野生一枝蒿幼嫩叶片组织为材料，利用SMART（Sw itching Mechanism At5′end of the RNA Transcript）技术，首次构建其幼嫩叶片组织cDNA文库，为进一步克隆一枝蒿相关功能基因及代谢途径研究奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

TC-512聚合酶链反应（PCR）仪（英国Techne公司）；DYCP-31DN琼脂糖水平电泳仪（北京市六一仪器厂）；DOC2000凝胶成像仪（美国Bio-rad公司）；1200紫外-可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；BS110S电子天平（德国Sartorius公司）。

1.2 药材

一枝蒿叶片于2014年5月采自新疆伊犁哈萨克自治州伊宁县（E80°33′31.230 0″，N44°10′12.666 0″，当一枝蒿的枝条长出5～10片真叶时开始采集），由新疆维吾尔自治区药物研究所何江副研究员鉴定为新疆一枝蒿（Artemisia rupestris L.）全草，双蒸水清洁后用滤纸吸干水分，迅速放入液氮中，于－80℃冰箱贮存，备用。

1.3 试剂与其他

Trizol试剂、琼脂糖（美国赛默飞世尔科技公司，批号：15596026、2014101121）；SMARTTMcDNA文库构建试剂盒（cDNA Library Construction Kit）、蛋白测试试剂盒（Advantage2 PCR Kit，美国Clontech公司，批号：2014101121、639206）；核酸分子量标准品DL2000（分子量：750 bp）、T4DNA连接酶均购自大连TaKaRa公司；蛋白酶K、牛血清白蛋白（BSA）均购自上海雅心生物技术有限公司；焦碳酸二乙酯（DEPC）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、水饱和酚、β-巯基乙醇（BME）均购自北京鼎国生物技术有限公司；氯仿、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、冰乙酸等均为分析纯；水为双蒸水。

2 方法

采用改良Trizol法提取一枝蒿幼嫩叶片总RNA，反转录成单链cDNA，长距离聚合酶链反应法（LD-PCR）合成双链cDNA；PCR产物经蛋白酶K消化，采用sfiⅠ酶切；酶切产物用CHROMA SPIN-400柱分级分离，回收0.4 kb以上的cDNA，以λTriplE×2噬菌体连接并进行体外蛋白包装；利用SMART技术构建一枝蒿全长cDNA文库并进行质量评价，详细操作如下。

2.1 总RNA提取

称取一枝蒿叶片组织约100mg，放入经预冷的研钵里，在液氮中充分研磨。用改良Trizol法[3]提取一枝蒿叶片总RNA，加入经DEPC处理的水20µL以溶解RNA，电泳检测总RNA纯度，－80℃保存，备用。

2.2 单链与双链cDNA合成

cDNA双链合成参考cDNA文库构建试剂盒说明书操作。吸取3µL总RNA溶液作模板，以SMARTⅣ寡核苷酸（5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3′）和CDSⅢ/3′PCR引物[5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d（T）30（N-1）N-3′；N＝A，G，C，or T；N-1＝A，G，or C]作为反应体系引物，在SMART反转录酶的作用下合成单链cDNA。吸取2 µL单链cDNA产物作为合成双链cDNA的模板，采用LD-PCR法合成双链cDNA，即以5′PCR引物（5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′）和CDSⅢ/3′PCR引物作为体系引物。采用蛋白测试试剂盒合成双链cDNA，反应条件为：95℃20 s；95℃5 s；68℃6min，25个循环。吸取5µL PCR产物，采用1.1%琼脂糖凝胶电泳检测双链cDNA分布情况。

2.3 蛋白酶K消化及sfiⅠ酶切

吸取50µL双链cDNA（约2～3 g），加入2µL蛋白酶K，45℃水浴20min，用酚/氯仿抽提，进一步纯化产物，加入水溶解沉淀。然后依次加入10倍sfiⅠ缓冲液10µL、sfiⅠ酶10µL、100×BSA 1µL，充分混合后于50℃孵育2 h，孵育后加入1%二甲苯青2µL，混匀。

2.4 cDNA片段分级分离

将混有1%二甲苯青的cDNA加入到cDNA文库构建试剂盒中的CHROMA SPIN-400分离柱中，待渗入基质后加入过柱缓冲液100µL，待自然渗尽后，再加入过柱缓冲液600µL。将预先备好的16个离心管迅速放在柱下方，每管1滴直到缓冲液滴尽为止。每管取3µL上1.1%琼脂糖凝胶电泳。另取DL2000为对照，于150 V电泳10min，记录电泳图。选择分子量大于0.4 kb的3～4管，收集到新的离心管中，依次加入1/10倍体积（BV）醋酸钠（3mol/L，pH 4.8）、糖原（20mg/m L）1.3µL、2.5 BV 95%乙醇（－20℃），于－20℃静置过夜后，离心（离心半径为6.5 cm，下同，14 000 r/m in）20m in，弃去上清液，加入7µL水溶解沉淀。

2.5 cDNA片段与λTrip lE×2噬菌体的连接与包装

取灭菌的0.5m L离心管，加入“2.4”项处理后的cDNA1.0µL，依次加入cDNA文库构建试剂盒中的500 ng/µLλTriplE×2噬菌体（Vector）1.0µL、10×连接缓冲液（Ligation buffer）0.5µL、腺苷三磷酸（ATP，10 mmol/L）0.5µL、T4DNA连接酶0.5µL，轻柔混匀，16℃连接过夜。将噬菌体包装提取物置于冰上解冻，取25µL包装提取物加入到5µL连接产物中，30℃温育90m in，再加入25µL溶解后的包装提取物，30℃温育90m in后，加入500μL噬菌体稀释缓冲液，轻柔涡旋混匀；加入25μL氯仿，轻柔涡旋混匀；离心（10 000 r/min）30 s，取上清液，即得包装混合物，4℃冰箱贮存。

2.6 原始cDNA文库质量评价

从cDNA文库构建试剂盒中挑取一个复活的蓝色单菌落，接种于15m L普通培养基（LB）/硫酸镁（Mg-SO4）/麦芽糖液体培养基中，于37℃、140 r/min振荡培养过夜，离心（5 000 r/m in）5 m in，弃上清，用7.5 m L 10 mmol/LMgSO4重悬沉淀。准备适量90mm LB/MgSO4琼脂平板，37℃预热，分别取“2.5”项下包装混合物2 µL，共3份，用1×Ligation buffer稀释，体积比分别为1∶50、1∶500、l∶1 000。取各梯度稀释液10µL，分别加入200µL重悬菌液，混匀，37℃浸染20m in。将上述培养物加入到3m L 45℃LB/MgSO4/顶层琼脂（soft）培养基中，迅速混匀，立即倒入37℃预热的平板上，晃动平板使琼脂分散均匀，室温放置10m in以冷却上层胶。37℃倒置培养6～18 h，定期记录噬菌斑生长情况并计算文库滴度。文库滴度（pfu/m L）＝噬菌斑数×稀释倍数×103（µL/m L）/稀释噬菌体的铺板体积（µL）；原始库容量（pfu）＝文库滴度（pfu/m L）×连接产物总体积（m L）。培养基中加入异丙基硫代半乳糖苷（100mmol/L）50µL、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（100mmol/L）50µL过夜培养后，随机挑取20个噬菌斑单克隆，以F（5′-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3′）和R（5′-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC-3′）为正反引物，PCR检测其重组阳性率（%，嵌入载体的数量/总数量× 100%）与cDNA片段大小。

3 结果

3.1 总RNA分析

利用改良Trizol法提取一枝蒿叶片总RNA，经电泳检测表明，28 S和18 S的2个条带清晰，提示总RNA在提取过程中未发生降解，离散程度较低。这表明提取总RNA的纯度较高，符合构建cDNA文库的要求，电泳图见图1。

图1 总RNA电泳结果Fig 1 Electrophoresis resultsof totalRNA

3.2 双链cDNA的合成分析

双链cDNA经电泳检测分析表明，双链cDNA经电泳后形成一条弥散状条带，长度在0.1～5 kb范围内，进一步提示mRNA反转录成功，扩增产物的分子量范围符合构建cDNA文库的要求。

3.3 双链cDNA经sfiⅠ酶切及其分级分离分析

双链cDNA片段经过CHROMA SPIN-400分离柱分级分离，共收集到16管分离产物。经电泳检测分析表明，第8～10管cDNA产物片段大小均明显大于0.4 kb。合并这3管用于进一步试验，除去其余小分子cDNA片段。分级分离检验结果见图2。

图2 分级分离检验结果Fig 2 Classification and fractionation test results

3.4 原始cDNA文库质量评价结果

原始文库滴度为1.94×107pfu/m L，原始库容量为0.97×107pfu。20个噬菌斑单克隆进行菌落PCR检测，详见图3。

图3 PCR检测结果Fig 3 PCR test results

结果，除1、20单克隆未检测出条带，17出现双目的条带外，其余均得到了有效扩增。cDNA插入片段重组阳性率为96%，其中最大的cDNA片段约2 kb，最小的约为0.4 kb，cDNA片段大小主要分布在0.5～2.0 kb，0.75 kb片段超过50%，平均长度为0.9 kb左右，表明试验基本符合构建一枝蒿cDNA文库的要求。

4 讨论

在构建植物cDNA文库过程中，RNA纯度及其质量是试验中较为重要的环节，直接决定着后续试验的成功与否。由于同种或异种植物的不同组织中的组分与含量差异较大，因此，提取植物总RNA尚无统一通用的方法。必须针对不同植物材料的特点对提取方法进行选择性优化，才能得到高质量核酸[8]。本试验曾用Trizol法提取一枝蒿叶片总RNA，结果不理想，故需在原有Trizol法基础上进一步改良优化。因此，笔者采用巯基乙醇作为还原剂，分别用氯仿和水饱和酚抽提、用高浓度盐溶液进一步沉淀，以去除蛋白质、多糖、多酚等杂质，最后用无水乙醇沉淀总RNA。最后，获得的总RNA完整性较好、纯度较高，且操作简单、快速，符合进一步试验的要求。

通常构建cDNA文库的载体主要以质粒和噬菌体为主，质粒文库多适于表达丰度较高的mRNA，其低丰度cDNA克隆数量相对较少；而噬菌体文库多适用于表达丰度较低的mRNA，可大大提高低丰度cDNA的克隆数量。考虑到一枝蒿的某些功能基因可能为低丰度的表达，因此本试验选择λTriplE×2噬菌体作为本次构建一枝蒿cDNA文库的载体。一般评价cDNA文库的质量的标准主要是看其原始滴度、重组阳性率以及载体插入cDNA片段的长度[9-10]，原始文库滴度一般要求不低于106pfu/m L，重组阳性率＞85%以上方为有效文库。双链cDNA片段经过CHROMA SPIN-400柱分级分离，除去0.4 kb以下的小片段，避免了小片段优先与载体相连接，大大提高了其相关基因的完整性。在本试验中，一枝蒿cDNA文库原始文库滴度已达到1.94×107pfu/m L，PCR结果表明重组阳性率为96%，表明本试验所构建的文库是一个高库容、高质量的文库。

一枝蒿主要为新疆哈萨克族民间习用药材，随着新疆民族医药被越来越多的人认识和了解，一枝蒿的开发近年来急剧增长，野生资源已日益枯竭。一枝蒿适宜于中高海拔山地气候条件，人工栽培多因生态环境不适，加之资金、技术等因素制约，至今未成功实现规模化种植。另外，随着一枝蒿的药理作用被逐步证实，对其化学成分的研究日益受到重视。自本单位最早从一枝蒿中分离得到萜类成分一枝蒿酮酸和异一枝蒿酮酸以来[11-12]，其结构与活性已逐渐受到国内外的重视[13]。本研究通过构建新疆一枝蒿cDNA文库，进一步为其克隆、保护相关功能基因及开发有效次生代谢产物生物合成途径奠定了基础。

[1] 安争西，魏岩.新疆植物志：第五卷[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：153-178.

[2] 盛萍.新疆一枝蒿体外抗肿瘤物质基础及制备工艺研究[D].乌鲁木齐：新疆医科大学，2008.

[3] 王颖.人参叶和根cDNA文库构建及表达序列标签分析[D].长春：东北师范大学，2007.

[4] CuiGH，Huang LQ，Tang XJ，et al.Functional genomics studies of salviam iltiorrhizaⅠestablish cDNAm icroarray of S.m iltiorrhiza[J].Journal of Chinese Medicinal Materials，2007，32（12）：1137-1140.

[5] Jiang M，Wang J，Wen GS，et al.Construction and sequence analysis of a normalized full-length cDNA library of Dendrobium officinal[J].Journal ofChinese Medicinal Materials，2013，38（4）：504-509.

[6]Yang Q，Zhang H，Wang WQ，et al.Construction and analysis of root cDNA library in Glycyrrhiza uralensis[J]. China Journal ofMateria Medica，2008，33（12）：1386-1389.

[7] Zhao S，Dong X，Ma T.Construction and prelim inary analysis of a full-length cDNA library for paris polyphylla var.yunnanensis[J].Journal ofChinese MedicinalMaterials，2014，37（1）：22-25.

[8] 吴林.半夏高温倒苗过程中总RNA及基因差异表达片段的研究[D].武汉：华中农业大学，2008.

[9] 秦子茹，贺金华，顾政一，等.一枝蒿不同溶剂提取物抗病毒作用的谱效关系研究[J].中国药房，2015，26（7）：889-893.

[10] Yang Y，Gu D，Yi LA，etal.One step separation and purification of rupestonic acid and chrysosptertin B from artemisia rupestris L.by high speed counter current chromatography[J].Phytochem Anal，2010，21（2）：205-209.

[11] Gu ZY，He JH，Yang X，et al.Quantitative determ ination of rupestonic acid in rat plasma by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and its application in a pharmacokinetic study[J].Biomed Chromatoqr，2013，27（5）：563-567.

[12] He YW，Dong CZ，Zhao JY，etal.1，2，3-Triazole-containing derivatives of rupestonic acid：click-chemical synthesis and antiviral activities against influenza viruses[J]. Eur JMed Chem，2014，76：245-255.

[13] Yong J，Lu C，Aisa HA.Advances in studieson the rupestonic acid derivativesasanti-influenza agents[J].MiniRev Med Chem，2013，13（2）：310-315.

Study on the cDNA Library Construction M ethod for Xinjiang Artem isia rupestris

LIU Chong，CHENG Bo，HE Jiang，YANGWeijun，DILINUER·Tuerxunjiang，MERHABA·Heyrulla，XUE Guipeng，WEIMeimei，WANG Xue（Xinjiang Institute of Materia Medica/Key Laboratory of Xinjiang Uighur Medicine，Urumqi830004，China）

OBJECTIVE：To establish amethod for full-length cDNA library of Xinjiang Artemisia rupestris.METHODS：Modified Trizolmethod was adopted to extract total RNA in young leaves of A.rupestris，itwas transcribed into single-strand cDNA，and then synthesized into double-strand cDNA by long-distance polymerase chain reaction（LD-PCR）method.PCR productwas digested by proteinase K and sfiⅠ，and then fractionated by CHROMA SPIN-400 columns.The cDNA longer than 0.4 kb were collected and ligated to phageλTriplE×2，and then protein packaging was performed.Full-length cDNA library was established by SMART technology.20monoclonalwere random ly selected from the library，and electrophoresiswas used to determine the primary library titer，library capacity，recombinant positive rate and length of insert cDNA.RESULTS：The primary library titer was 1.94× 107pfu/m L，library capacity was 0.97×107pfu；recombinant positive rate of insert cDNA was 96%and length was 0.5-2.0 kb w ith an average of 0.9 kb.CONCLUSIONS：The established library is high in capacity and quality，which can provide basis for establishing cDNA library of Xinjiang A.rupestris.

Xinjiang；Arternisia rupestris；cDNA library；Construction；Functional gene

R282.5

A

1001-0408（2017）13-1793-04

2016-08-10

2017-01-03）

（编辑：刘明伟）

新疆维吾尔自治区公益性科研院所基本科研业务经费资助项目（No.KY2015121）；新疆维吾尔自治区青年科技创新人才培养工程项目（No.2013721034）

＊副研究员，博士研究生。研究方向：药用植物资源与利用。E-mail：liu_chong02@163.com

#通信作者：研究员，博士。研究方向：维吾尔药资源。E-mail：w ilfred3106@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.19