HPLC法测定氨氯地平氢氯噻嗪缬沙坦片中的有关物质

李亚萍，王 静，周立新，陆步实#（1.南京工业大学药学院，南京 11816；.江苏省药物研究所有限公司，南京 10009）

HPLC法测定氨氯地平氢氯噻嗪缬沙坦片中的有关物质

李亚萍1＊，王 静2，周立新2，陆步实2#（1.南京工业大学药学院，南京 211816；2.江苏省药物研究所有限公司，南京 210009）

目的：建立测定氨氯地平氢氯噻嗪缬沙坦片中有关物质的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Symmetry C18，流动相为[水-乙腈-三氟乙酸（90∶10∶0.1，V/V/V）]-[水-乙腈-三氟乙酸（10∶90∶0.1，V/V/V）]（梯度洗脱），流速为0.6 mL/min，检测波长为237 nm（杂质A）和225 nm（杂质B、C、D），柱温为30 。结果：杂质A、B、C、D检测质量浓度线性范围分别为93.43～987.34 ng/mL（r＝0.999 4）、12.27～255.92 ng/mL（r＝0.999 6）、78.96～657.17 ng/mL（r＝0.999 9）、28.39～218.16 ng/mL（r＝0.999 7）；定量限分别为91.27、11.35、78.31、26.56 ng，检测限分别为22.98、3.13、19.17、8.16 ng；精密度的RSD＜2.0%，稳定性、重复性试验中只检出杂质A，RSD＝0.79%；回收率分别为99.4%～100.6%（RSD＝0.41%，n＝9）、98.9%～102.0%（RSD＝1.04%，n＝9）、99.4%～100.9%（RSD＝0.56%，n＝9）、98.6%～101.2%（RSD＝0.92%，n＝9）。结论：该方法简便、快速、灵敏、重复性好，可用于测定氨氯地平氢氯噻嗪缬沙坦片中的有关物质。

氨氯地平；氢氯噻嗪；缬沙坦；有关物质；高效液相色谱法；氨氯地平氢氯噻嗪缬沙坦片

氨氯地平氢氯噻嗪缬沙坦片是2009年FDA批准诺华公司研发的复方制剂，商品名为Exforge HCT，其主要成分为氨氯地平（Amlodipine）、氢氯噻嗪（Hydrochlorothiazide）和缬沙坦（Valsartan），均为长效降压药，本制剂适用于单一药物治疗不能控制血压的患者，其中氨氯地平属于钙离子拮抗药，氢氯噻嗪属于利尿药，缬沙坦属于血管紧张素Ⅱ受体拮抗药[1]，这3种成分可通过不同的机制发挥降压作用，疗效及耐受性均较好，大大提高了患者用药依从性[2]；此外，该制剂对靶器官有较好的保护作用[3-6]。

现有文献只对氨氯地平氢氯噻嗪缬沙坦片中1种或2种主要成分的有关物质进行分析，未有同时测定该制剂中3种主要成分的有关物质的报道[7-10]，因此笔者采用高效液相色谱法（HPLC）建立了测定氨氯地平氢氯噻嗪缬沙坦片中有关物质的方法，以期为完善该制剂的质量控制标准提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260型HPLC仪，包括1260型可变波长紫外检测器、安捷伦工作站等（美国Agilent公司）；UV-2450型紫外分光光度计（日本Shimadzu公司）；BS21S型电子天平（德国Sartorius公司）；KQ-200KDE型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率：200 W，频率：40 kHz）。

1.2 药品与试剂

氨氯地平氢氯噻嗪缬沙坦片（江苏省药物研究所有限公司，批号：140506、140507、140508，规格：每片含氨氯地平5 mg，氢氯噻嗪12.5 mg，缬沙坦80 mg）；氨氯地平对照品（批号：100374-201204，纯度：99.6%）、氢氯噻嗪对照品（批号：100309-201103，纯度：99.0%）、缬沙坦对照品（批号：100651-200902，纯度：98.9%）均购自中国食品药品检定研究院；杂质A对照品（批号：G0L172，纯度：99.5%）、杂质B对照品（批号：I0F027，纯度：98.2%）、杂质C对照品（批号：H1K270，纯度：99.5%）均购自美国药典委员会；杂质D对照品（江苏省药物研究所有限公司，批号：201405，纯度：98.5%）；乙腈、三氟乙酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为高纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Symmetry C18（150 mm×3.0 mm，5µm）；流动相：[水-乙腈-三氟乙酸（90∶10∶0.1，V/V/V）]（A）-[水-乙腈-三氟乙酸（10∶90∶0.1，V/V/V）]（B），梯度洗脱（0 min，80%A；20 min，20%A；25 min，80%A；35 min，80%A）；流速：0.6 mL/min；检测波长：237 nm（杂质A）和225 nm（杂质B、C、D）；柱温：30 。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取杂质A对照品10 mg、杂质B对照品2.5 mg、杂质C对照品6.4 mg和杂质D对照品5 mg，置于同一100 mL量瓶中，加乙腈-水（1∶1，V/V）定容，摇匀，作为混合对照品贮备液。取上述混合对照品贮备液10 mL，置于100 mL量瓶中，加乙腈-水（1∶1，V/V）定容，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 取样品细粉适量（相当于氨氯地平5 mg），置于100 mL量瓶中，加乙腈-水（1∶1，V/V）定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 空白溶液 精密称取处方量的空白辅料适量，置于100 mL量瓶中，加乙腈-水（1∶1，V/V）定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 系统适用性溶液 精密称取氨氯地平对照品5 mg、氢氯噻嗪对照品12.5 mg和缬沙坦对照品20 mg，置于同一100 mL量瓶中，加入“2.2.1”项下混合对照品贮备液10 mL，加乙腈-水（1∶1，V/V）定容，摇匀，即得。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、空白溶液、系统适用性溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，分离度＞1.5；理论板数以氨氯地平峰计≥2 500，氨氯地平保留时间为13.349 min、氢氯噻嗪保留时间为4.168 min、缬沙坦保留时间为17.975 min、杂质A保留时间为11.620 min、杂质B保留时间为3.412 min、杂质C保留时间为16.336 min、杂质D保留时间为6.958 min。结果表明，其他成分对测定无干扰。

图1 系统适用性试验高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of system suitability test

2.4 破坏性试验

2.4.1 酸破坏样品溶液 精密称取样品（批号：140506）适量，置于50 mL量瓶中，加1 mol/L盐酸溶液2 mL，于室温下放置2 h，加1 mol/L氢氧化钠溶液2 mL调节pH至中性，再加乙腈-水（1∶1，V/V）溶解并定容，摇匀，即得。

2.4.2 碱破坏样品溶液 精密称取样品（批号：140506）适量，置于50 mL量瓶中，加1 mol/L氢氧化钠溶液2 mL，于室温下放置2 h，加1 mol/L盐酸溶液2 mL调节pH至中性，再加乙腈-水（1∶1，V/V）溶解并定容，摇匀，即得。

2.4.3 氧化破坏样品溶液 精密称取样品（批号：140506）适量，置于50 mL量瓶中，加30%过氧化氢溶液

1 mL，于室温下放置2 h，加乙腈-水（1∶1，V/V）溶解并定容，摇匀，即得。

2.4.4 高温破坏样品溶液 精密称取样品（批号：140506）适量，置于50 mL量瓶中，于沸水（100 ）中加热5 h，加乙腈-水（1∶1，V/V）溶解并定容，摇匀，即得。

2.4.5 光破坏样品溶液 精密称取样品（批号：140506）适量，置于50 mL量瓶中，于人工气候箱中（温度：25 ，照度：4 500 lx）照射18 h，加乙腈-水（1∶1，V/V）溶解并定容，摇匀，即得。

取上述各破坏样品溶液各10µL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图2。由图2可知，本品在上述条件下，产生的降解产物均能与主成分峰达到有效分离。

2.5 线性关系考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测杂质质量浓度（x，ng/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得杂质A、B、C、D回归方程分别为y＝0.125x－4.130 5（r＝0.999 4）、y＝0.067 6x+ 0.100 3（r＝0.999 6）、y＝0.090 7x－1.486 9（r＝0.999 9）、y＝0.081 6x－1.395（r＝0.999 7）。结果表明，杂质A、B、C、D检测质量浓度线性范围分别为93.43～987.34、12.27～255.92、78.96～657.17、28.39～218.16 ng/mL。

2.6 定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得定量限（LOQ）；当信噪比为3∶1时，得检测限（LOD）。结果，杂质A、B、C、D的LOQ分别为91.27、11.35、78.31、26.56 ng，LOD分别为22.98、3.13、19.17、8.16 ng。

2.7 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，杂质A、B、C、D峰面积的RSD分别为1.01%、0.39%、1.22%、0.98%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，杂质D峰面积的RSD为0.98%（n＝5），其他成分未检出，表明供试品溶液在室温放置8 h内稳定性良好。

2.9 重复性试验

取样品细粉（批号：140506）适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，杂质A峰面积的RSD＝0.79% （n＝6），其他成分未检出，表明本方法重复性良好。

2.10 回收率试验

图2 破坏性试验高效液相色谱图Fig 2 HPLC chromatograms of destructive test

精密称取杂质A、B、C、D各适量，共9份，分别置于100 mL量瓶中，加乙腈-水（1∶1，V/V）溶解并定容，按“2.2.2”项下方法制成低、中、高3种不同质量浓度的供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率，结果见表1。

2.11 样品有关物质测定

取3批样品（批号：140506、140507、140508）各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按外标法计算样品中的有关物质。结果，3批样品中只有1批（批号：140508）只检测出杂质D，其含量为0.01%。

表1 回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

3 讨论

3.1 检测波长和柱温的选择

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，在200～400 nm波长处进行全波长扫描，发现在237 nm波长处杂质A有最大吸收，在225 nm波长处杂质B、C、D有较大吸收，因此最终确定本试验的检测波长为237 nm（杂质A）和225 nm（杂质B、C、D）。在预试验中，笔者发现温度过低会导致氨氯地平、氢氯噻嗪和缬沙坦主峰与其相邻的有关物质峰分离度不佳，造成干扰，故选用30为本试验的柱温。

3.2 有关物质的确定

根据氨氯地平、氢氯噻嗪和缬沙坦原料的合成路线和可能的降解模式，氨氯地平涉及的有关物质为杂质A，其在氧化、光照及高温条件下均可产生；氢氯噻嗪涉及的有关物质有氯噻嗪、氢氯噻嗪二聚物和苯并噻二嗪（即杂质B），其中氯噻嗪是合成过程中间体，氢氯噻嗪二聚物是合成过程中的副产物，杂质B是氢氯噻嗪降解产物及该药质量控制中的主要有关物质[4-5]；缬沙坦涉及的有关物质有杂质C、杂质E及缬沙坦水解产物（杂质D）[6]，其中杂质E是缬沙坦的手性异构体，其检测可在另一色谱系统下用手性色谱柱进行研究，本系统不对杂质E做具体说明，杂质C是缬沙坦同系物副产物，杂质D为缬沙坦水解产物。

综上所述，本方法简便、快速、灵敏、重复性好，可用于测定氨氯地平氢氯噻嗪缬沙坦片中的有关物质。

[1] 刘晓云，宋建国.抗高血压单片复方制剂缬沙坦/氨氯地平临床药理学研究进展[J].中国执业药师，2011，8（12）：31-36.

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[4] 吴善霞，刘延风.HPLC法同时测定缬沙坦氢氯噻嗪片中两组分的含量[J].科学研究，2012，32（3）：153-155.

[5] 王焕，王国振.氢氯噻嗪分散片中有关物质苯并噻二嗪有关物质A的研究[J].河北医药，2012，34（16）：2519-2521.

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（编辑：刘 柳）

Determination of Related Substance in Amlodipine Hydrochlorothiazide and Valsartan Tablets by HPLC

LI Yaping1，WANG Jing2，ZHOU Lixin2，LU Bushi2（1.College of Pharmacy，Nanjing Tech University，Nanjing 211816，China；2.Jiangsu Province Institute of Materia Medica Co，Ltd.，Nanjing 210009，China）

OBJECTIVE：To establish the method for simultaneous determination of related substances in Amlodipine hydrochlorothiazide and valsartan tablets.METHODS：HPLC method was used.The determination was performed on Symmetry C18column with mobile phase consisted of water-acetonitrile-trifluoroacetic acid（90∶10∶0.1，V/V/V）and water-acetonitrile-trifluoroacetic（10∶90∶0.1，V/V/V）（gradient elution）at the flow rate of 0.6 mL/min.The detection wavelength was set at 237 nm（impurity A）and 225 nm（impurity B，C，D）.The column temperature was 30 .RESULTS：The linear range of impurity A，B，C，D were 93.43-987.34 ng/mL（r＝0.999 4），12.27-255.92 ng/mL（r＝0.999 6），78.96-657.17 ng/mL（r＝0.999 9），28.39-218.16 ng/mL（r＝0.999 7），respectively.The limits of quantitation were 91.27，11.35，78.31，26.56 ng；the limits of stability and detection were 22.98，3.13，19.17，8.16 ng.RSDs of precision tests were lower than 2.0%.Only impurity A was found in repeatability test，RSD＝0.79%.Recoveries were 99.4%-100.6%（RSD＝0.41%，n＝9），98.9%-102.0%（RSD＝1.04%，n＝9），99.4%-100.9%（RSD＝0.56%，n＝9），98.6%-101.2%（RSD＝0.92%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，rapid，sensitive and repeatable，and can be used for the determination of related substance in Amlodipine hydrochlorothiazide and valsartan tablets.

Amlodipine；Hydrochlorothiazide；Valsartan；Related susbtance；HPLC；Amlodipine hydrochlorothiazide and valsartan tablets

R927.2

A

1001-0408（2017）12-1714-04

2016-05-22

2017-01-22）

＊硕士研究生。研究方向：药剂学。电话：025-58139411。E-mail：liyaping0816@163.com

#通信作者：研究员，硕士。研究方向：药物制剂。E-mail：bushi89@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.12.36