UPLC-MS/MS法快速筛查抗风湿类中药贴剂中非法添加的17种化学药物成分Δ

李 强，岳 磊，李晓静（1.河南省食品药品审评查验中心，郑州 450018；郑州市食品药品检验所，郑州450015；3.郑州大学第三附属医院，郑州 45005）

UPLC-MS/MS法快速筛查抗风湿类中药贴剂中非法添加的17种化学药物成分Δ

李 强1＊，岳 磊2，李晓静3#（1.河南省食品药品审评查验中心，郑州 450018；2郑州市食品药品检验所，郑州450015；3.郑州大学第三附属医院，郑州 450052）

目的：建立快速筛查抗风湿类中药贴剂中非法添加的9种糖皮质激素和8种非甾体抗炎药物成分的方法。方法：采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）。色谱条件：色谱柱Acquity UPLC®BEN C18，流动相为甲醇-水（90∶10，V/V），流速为0.4 mL/min，柱温为30 ，进样量为1 μL；质谱条件：离子源为电喷雾离子源，喷雾针电压为5 500 V，离子源喷雾气GS1、GS2分别为50、50 psi，离子源温度为500 ，扫描范围为m/z 50～550，检测方式为正负离子模式，多反应监测（MRM）联合相关信息扫描（IDA）和增强离子扫描（EPI）模式。结果：17种化学药物成分检测限均≤0.400 μg/mL。精密度、重复性、稳定性试验的RSD分别≤4.93%、7.69%、9.57%。实测样品中可检出双氯芬酸钠。结论：该方法专属性强、灵敏度高，适用于抗风湿类中药贴剂中非法添加化学药物成分的定性分析。

超高效液相色谱-串联质谱法；多反应监测；抗风湿类中药贴剂；非法添加；糖皮质激素；非甾体抗炎药

随着国家经济及互联网技术的发展，以电商为主的网络销售平台开始出现各种名目繁多的中药，抗风湿类中药贴剂因使用方便、疗效独特、不良反应小而广受患者欢迎；但多数显效慢，需长期使用，不法分子利用患者求治心切，为凸显产品疗效，非法添加功能性化学药品的现象非常普遍[1]，且所添加的化学药种类也逐年增多[2-4]。抗风湿类中药非法添加物检测现行的国家标准为国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件（编号：2009025），该标准主要针对双氯芬酸钠、对乙酰氨基酚等非甾体抗炎药进行筛查，对于滥用危害性更大的糖皮质激素类药物仅有氢化可的松、醋酸泼尼松和地塞米松3种，尚不能满足日常检验的需求[5]。而药品检测前处理仅针对片剂、胶囊剂及大蜜丸进行了简单描述，对贴剂等尚无前处理操作标准。

抗风湿类中药中非法添加物的检测方法有薄层色谱法[6-7]、高效液相色谱法[8-9]、液相色谱-质谱法[10-11]等，本课题组采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/ MS）技术，使用多反应监测（MRM）联合相关信息扫描（IDA）、增强离子扫描（EPI）的方式，建立了同时检测抗风湿类中药贴剂中17种抗炎类化学药物成分（包括9种糖皮质激素和8种非甾体抗炎药）的快速检验方法；其中，新增糖皮质激素类药物成分6种，检测效率得到提高。

1 材料

1.1 仪器

Acquity UPLC仪（美国Waters公司）；4000QTrap型MS仪（美国SCIEX公司）；HU10300/40B型超声波清洗机（上海楚定分析仪器有限公司，功率：300 W，频率：40 kHz）。

1.2 试剂

实测样品来自郑州市食品药品监督管理局抽检样品（A公司，批号：150523-177，规格：100 mm×70 mm）；氢化可的松对照品（批号：100152-200206，纯度：100.0%）、醋酸可的松对照品（批号：100123-201204，纯度：99.2%）、地塞米松对照品（批号：100129-201506，纯度：99.7%）、醋酸泼尼松对照品（批号：100012-201407，纯度：99.7%）、醋酸泼尼松龙对照品（批号：100124-201104，纯度：99.2%）、醋酸氟轻松对照品（批号：100010-201108，纯度：99.6%）、丙酸倍氯米松对照品（批号：100119-201504，纯度：99.0%）、倍他米松对照品（批号：100118-201204，纯度：100.0%）、糠酸莫米松对照品（批号：100930-201201，纯度：99.9%）、氨基比林对照品（批号：100503-201302，纯度：99.9%）、布洛芬对照品（批号：100179-201406，纯度：98.8%）、双氯芬酸钠对照品（批号：100324-200302，纯度：100.0%）、吲哚美辛对照品（批号：100258-200904，纯度：99.9%）、对乙酰氨基酚对照品（批号：100018-201409，纯度：100.0%）、吡罗昔康对照品（批号：100177-200603，纯度：99.8%）、萘普生对照品（批号：100198-201205，纯度：99.9%）、保泰松对照品（批号：100481-200601，纯度：99.9%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙酸铵、乙酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 试验条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Acquity UPLC®BEN C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：甲醇-水（90∶10，V/V）；流速：0.4 mL/min；柱温：30 ；进样量：1 μL。

2.1.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源（ESI）；检测方式：正负离子模式；MRM联合IDA和EPI模式；喷雾针电压（IS）：5 500 V；离子源温度（TEM）：500 ；离子源喷雾气（GS1、GS2）：50、50 psi；扫描范围：m/z 50～550。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 取各待测成分对照品各约10 mg，精密称定，分别置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得单一对照品贮备液。精密量取上述各单一对照品贮备液1.00 mL，分别置于100 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，制成单一对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取样品1次用量，撕开不粘层，展开，贴在定量滤纸上，用剪刀裁去多余滤纸，再将样品裁剪成小片，置于50 mL烧杯中，加甲醇适量，超声处理30 min，滤过，续滤液放冷至室温，精密量取1.00 mL，置于100 mL量瓶中，加甲醇定容，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3 空白对照溶液 取空白贴剂1份，按“2.2.2”项下方法操作，制成空白对照溶液。

2.3 专属性试验

取“2.2.1”项下对照品溶液各适量，按“2.1”项下试验条件进样测定，记录色谱，详见图1、图2。结果显示，空白贴剂（图略）及前处理中涉及到的相关物质对目标物的测定不产生干扰，方法专属性强。

2.4 检测限考察

精密量取“2.2.1”项下对照品溶液各适量，倍比稀释，按“2.1”项下试验条件进样测定，当信噪比为3∶1时，得检测限，详见表1。

2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下对照品溶液各适量，按“2.1”项下试验条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，各待测成分峰面积的RSD为0.88%～4.93%（n＝6），表明仪器精密度良好，详见表1。

2.6 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：150523-177）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、12 h时按“2.1”项下试验条件进样测定，记录峰面积。结果，各待测成分峰面积的RSD为5.97%～9.57%（n＝6），表明供试品溶液在室温放置12 h内基本稳定，详见表1。

2.7 重复性试验

精密称取同一批样品（批号：150523-177）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下试验条件进样测定，记录峰面积。结果，各待测成分峰面积的RSD为1.81%～7.69%（n＝6），表明本方法重复性良好，详见表1。

2.8 样品中化学药物成分检测结果

若供试品出现与某对照品所有选择离子对质量数（见表1）、色谱峰保留时间一致，且两个选择离子峰高比与对照品一致，则确认供试品中添加相应的对照品成分。如上述指标不能完全确认检出，则调用EPI模式扫描得到的二级子离子全扫描图谱，与对照品标准图谱进行比对，确认是否存在非法添加，详见图3。由图3可见，多个成分在保留时间上虽然不能达到完全分离，但因MRM扫描方式下单特征离子对具备专一选择性，不会造成相互间的干扰；而EPI模式下得到的二级子离子图具备的独特性可以用来进一步的比对、验证，减少误判的可能性。实测样品总离子流（TIC）图中在保留时间0.38 min处出现色谱峰，响应的MRM离子对分别为294.002/249.900、294.002/213.800，离子对强度比为3.22%；与对照品TIC图中双氯芬酸钠色谱峰的保留时间一致，响应离子对相同且离子对强度比近似。进一步将二者EPI图谱进行比对，结果样品在294.2（M－1）、296.2（M+1）均有响应，高度比符合含氯化合物质谱规律，其二级子离子图谱中存在250.0、227.0、189.0碎片，碎片强度分布与双氯芬酸钠对照品相似，可确认样品中存在非法添加双氯芬酸钠化学药物成分。

图1 17种对照品的总离子流色谱图Fig 1 TIC chromatogram of 17 kinds of reference standard

图2 17种对照品的增强离子扫描二级子离子图Fig 2 EPI second-level daughterion diagram of 17 kinds of reference standard

表1 17种对照品质谱条件优化结果与方法学、检测限结果Tab 1 Result of MS optimization，methodology and LOD for 17 substance control

图3 实测样品的总离子流色谱图与增强离子扫描二级子离子图Fig 3 TIC chromatogram and EPI second-level daughterion diagram of measured samples

3 讨论

笔者考察了甲醇-水、甲醇-乙酸铵溶液、甲醇-乙酸溶液3个流动相体系。结果表明，甲醇-水（90∶10，V/V）能保证全部化合物有效洗脱，保留时间更为稳定，且可有效减少前处理过程及柱平衡时间。

贴剂的不干胶层具有一定的黏合强度，如果不加处理，极易以不规则形态黏在烧杯上，直接进行裁剪又容易黏附在剪刀、操作台或操作员的手套上，均会影响提取效果。笔者曾使用硅藻土帮助裁剪与提取，但硅藻土存在粉体逸散。后采用将贴剂黏在滤纸上进行裁剪提取，既方便操作又可减少交叉污染。

液质联用法检测非法添加物时常采用MRM模式进行定性或定量分析[12-13]，其扫描方式专属性较强、重复性好、便于定量操作[14]。但依照现有标准，MRM模式下进行定性的关键参数为所选择离子对强度比，该数值在不同条件下存在较大偏差，同时因中药基质复杂，假阳性现象时有发生，故其定性结果的准确性相对不足。

我国《药品管理法》中明确规定，药品所含成分与国家药品标准规定的成分不符，可直接判定为假药。由此可见，对于中药贴剂，一旦发现其存在药品标准规定之外的非法添加化学药物成分，无论其含量是否与临床治疗量匹配，都可作为违法判定的直接证据，因此在非法添加类检验参数中，对样品定性的准确性要求远远高于对定量精密度的要求。

针对上述问题，可采用常规MS/MS模式取得二级子离子全扫描图来辅助定性。在该模式下，样品分子在进入第一重四级杆（Q1）后进行分子离子检测，在第二重四级杆（碰撞池）中被碰撞气体分子打碎之后进入第三重四级杆（Q3）检测碎片离子，由软件统一记录数据后形成二级子离子全扫描图，以取得足够多的碎片离子特征数据来进行准确判定。但该模式需样品提供足够浓度来保证二级子离子全扫描图的完整性，而样品浓度过高会使得进样针、定量环甚至样品注射器中存在样品残留，进而可能导致后续样品出现假阳性现象。

笔者采用MRM联合IDA和EPI的扫描方式，在IDA-EPI模式下，当MRM获得的信号强度超过阈值后，机器开始启动普通三重四级杆（QQQ）与线性离子阱（Trap）模式的高频切换，在Trap模式下，Q3除具备测定碎片离子的功能外，还可同时对碎片离子进行富集，因此能在更低的样品浓度条件下采集更为完整的二级子离子全扫描图。将样品的二级子离子全扫描图谱与对照品图谱进行比对后可对样品进行定性判断，从而进一步减少复杂基质造成的影响；同时因可使用更低的样品浓度，在样品配制时能增加稀释倍数以避免样品残留，减少样品浓度过大而造成的假阳性现象。

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Rapid Determination of 17 Chemicals Illegally Added into Anti-rheumatic TCM Patches by UPLC-MS/MS

LI Qiang1，YUE Lei2，LI Xiaojing3（1.Henan Food and Drug Inspection Center，Zhengzhou 450018，China；2. Zhengzhou Institute for Food and Drug Control，Zhengzhou 450015，China；3.The Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China）

OBJECTIVE：To establish a rapid determination method for 9 kinds of glucocorticoid and 8 kinds of non-steroidal anti-inflammatory drugs illegally added into anti-rheumatic TCM patches.METHODS：UPLC-MS/MS method was adopted.The samples were separated on Acquity UPLC®BEN C18column with methanol-water（90∶10，V/V）as mobile phase at flow rate 0.4 mL/min.The column temperature was set at 30 ，and sample size was 1 μL.The ionization mode was electrospray ion source （ESI）：spray needle voltage of 5 500 V，ion source spray GS1，GS2 pressure of 50，50 psi，ion source temperature of 500 ，scanning range of m/z 50-500.The multiple reaction monitoring（MRM）combined with information-dependent acquisition（IDA）and enhanced product ion scanning（EPI）was used to rapid qualitative analysis.RESULTS：The detection limits for 17 kinds of chemical components were not more than 0.400 μg/mL.RSDs for precision，repeatability，stability tests were not more than 4.93%，7.69%，9.57%，respectively.Diclofenac sodium was detected in the sample.CONCLUSIONS：The method is selective and sensitive.It is suitable for qualitative analysis of chemicals illegally added into anti-rheumatism TCM patches.

UPLC-MS/MS；MRM；Anti-rheumatism TCM patches；Illegally added；Glucocorticoid；Non-steroidal anti-inflammatory drugs

R917

A

1001-0408（2017）12-1692-05

2016-05-07

2016-08-21）

（编辑：张 静）

郑州地方高校新世纪教育教学改革及人才培养工程立项项目（No.ZZJG-B7027）

＊主管药师，硕士。研究方向：中药质量控制与不良反应。电话：0371-68683820。E-mail：fishsoft008@163.com

#通信作者：主管药师，讲师，硕士。研究方向：药物质量分析。E-mail：lixiaojing2050@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.12.30