胆管癌组织紧密连结蛋白18、丝氨酸蛋白酶抑制剂和p53蛋白表达及其临床意义

曹光材，白江江，戴阿利

胆管癌组织紧密连结蛋白18、丝氨酸蛋白酶抑制剂和p53蛋白表达及其临床意义

曹光材，白江江，戴阿利

目的探讨胆管癌组织紧密连结蛋白18（claudin-18）、丝氨酸蛋白酶抑制剂（maspin）和p53蛋白表达的临床意义。方法采用免疫组化和Western blot法检测46例胆管癌和32例正常胆管组织claudin-18、maspin和p53蛋白的表达，采用Spearman等级相关分析。结果胆管癌组织claudin-18和p53蛋白阳性率分别为52.17%和56.52%，显著高于正常胆管组织（0.0%和0.0%，P＜0.01）；胆管癌组织maspin阳性率为86.96%，显著低于正常胆管组织（100.0%，P＜0.01）；胆管癌组织claudin-18、maspin和p53蛋白表达量分别为2.83±0.52、2.45±1.24和1.73± 1.26，均显著高于正常胆管组织（0.48±0.75、0.46±0.32和0.0±0.0，P＜0.05）；胆管癌组织maspin与p53表达呈负相关（r=-8.546，P=0.001）。结论胆管癌组织maspin、claudin-18和p53蛋白表达的意义还有待于进一步研究。

胆管癌；紧密连结蛋白18；丝氨酸蛋白酶抑制剂；p53；免疫组化；蛋白印迹法

胆管癌（Bile duct cancer，BDC）患者的早期诊断较困难，致使手术切除率低，预后极差，但目前尚不清楚其发生、发展的分子机制[1，2]。因此，寻找和研究与胆管癌发生相关的基因及表达产物的变化对其防治具有十分重要的意义[3]。Claudin-18蛋白是细胞间紧密连接结构的骨架蛋白。近年来，研究证实Claudin蛋白与肺癌、胃癌、结直肠癌等多种肿瘤的发生、发展及预后有关。然而，目前尚不清楚claudin-18在胆管癌患者中的表达情况[4]。 Maspin是最新发现的一种肿瘤抑制基因。研究表明，maspin与丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族具有高度的同源性，它们都与细胞外基质的降解有着密切的关系。同为抑癌基因的p53也参与抑制细胞生长及肿瘤发生发展过程[5，6]。目前的研究发现，几乎所有类型的恶性肿瘤中均存在p53的功能缺失和结构突变。本研究检测了胆管癌组织claudin-18蛋白、maspin和p53表达情况，以探讨三者在胆管癌的发生、发展、浸润及转移过程中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料2012年6月～2016年8月我院肝胆外科收治的46例胆管癌患者手术切除组织的存档蜡块，男性26例，女性20例；年龄43～75（58.64± 10.36）岁。所有患者均经手术切除治疗，术前均未经放疗或化疗治疗。其中肝门部胆管癌28例，中、下段胆管癌18例；低分化癌16例，高、中分化癌30例；TNM分期Ⅰ期17例，Ⅱ期15例，Ⅲ期10例，Ⅳ期4例。选取同期临床资料保存完整的32例正常胆管组织作为对照，男性20例，女性12例；年龄44～76（58.56±10.34）岁。两组患者在年龄、性别方面比较差异无统计学意义（均P＜0.05）。本研究经我院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书，同意本研究。

1.2 胆管组织蛋白表达的检测羊抗人claudin-18多克隆抗体（购自美国Santa Cruz公司）；羊抗人p53单克隆抗体和羊抗人maspin单克隆抗体C-20（均购自福州迈新生物技术开发公司）。PV-6000试剂盒、浓缩型DAB试剂盒以及ECL试剂盒（均购自福州迈新生物技术开发公司）。采用免疫组织化学第二代聚合酶两步法（En Vision，PV）检测。所有手术标本均经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片，分别行HE染色和免疫组化染色。切片脱蜡、水化、3%过氧化氢室温下孵育10min，高压锅抗原修复后经PBS缓冲液冲洗。按PV-6000试剂盒说明书进行操作：滴加羊抗人claudin-18多克隆抗体、羊抗人p53单克隆抗体或羊抗人maspin单克隆抗体，经37℃孵育1～2 h或4℃过夜，PBS缓冲液冲洗2 min×3次，DAB显色。蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片、镜检。结果评定标准：细胞膜出现棕黄色细颗粒为阳性细胞。随机观察5个高倍镜视野（400×），阳性细胞＜25%为阴性（-）；25%～50%为弱阳性（+）；51%～75%为阳性（++）；＞75%为强阳性（+++），其中阴性（-）和弱阳性（+）为低表达，（++）和（+++）为高表达。

1.3 胆管组织claudin-18、maspin和p53蛋白水平检测采用Western blot法，取出经-80℃液氮保存的胆管癌组织细胞团块，预冷PBS缓冲液冲洗3次，加RIPA蛋白提取缓冲液（Tris-HCl，150mmol/L NaCl，pH7.4，1mmol/LEDTA，1%-TritonX-100，0.1%SDS，5mg/LLeupeptin，1mmol/L PMSF）提取蛋白，BCA法定量，调整蛋白浓度后加入4×蛋白上样缓冲液，煮沸5 min。加80μg蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上。5%脱脂奶粉室温下封闭2h，分别加入羊抗人claudin-18多克隆抗体、羊抗人p53单克隆抗体或羊抗人maspin单克隆抗体，经37℃孵育1～2 h或4℃过夜，PBST洗涤3次，每次10min。加入经适当稀释的HRP标记的兔抗羊IgG，室温（37℃）孵育2 h，PBST洗涤3次，每次10min，ECL显色，暗室内X线片曝光、显影、定影。然后，用GS800系统扫描图像，分析蛋白表达量。实验重复2次，取均值。

1.4 统计学处理应用SPSS19.0统计学软件对所得数据进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，采用独立样本t检验，采用Spearman等级相关性分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胆管癌组织与正常胆管组织claudin-18、maspin和p53表达情况胆管癌组织claudin-18、maspin和p53阳性率分别为52.17%（24/46）、86.96%（40/46）和56.52%（26/46），而在正常胆管组织阳性率分别为0.0%（0/32）、100.0%（32/32）和0.0%（0/32），差异均有统计学意义（P＜0.01，表1，图1、图2）。

表1 胆管癌组织与正常胆管组织claudin-18、maspin和p53表达量（±s）比较

表1 胆管癌组织与正常胆管组织claudin-18、maspin和p53表达量（±s）比较

例数claudin-18maspinp53胆管癌组织462.83±0.522.45±1.241.73±1.26正常胆管组织320.48±0.750.46±0.320.0±0.0 t 2.2353.5564.112 P 0.0240.0210.000

图1 胆管癌和正常胆管组织claudin-18、maspin和p53蛋白表达情况（Western blot法）

图2 胆管癌和正常胆管组织P53表达情况（PV二步法，400×）

2.2 不同临床和病理学指标胆管癌组织claudin-18、maspin和p53表达的比较在不同年龄、性别、肿瘤直径、组织分化程度组织claudin-18、maspin和p53表达无显著性差异（均P＞0.05）；不同TNM分期肿瘤组织claudin-18表达水平无显著性差异（P＞0.05），而p53和maspin表达水平差异具有统计学意义（均P＜0.05，表2）。

表2 不同特征胆管癌组织claudin-18、maspin和p53表达（±s）比较

表2 不同特征胆管癌组织claudin-18、maspin和p53表达（±s）比较

例数claudin-18t值P值maspint值P值p53t值P值年龄（岁）13.2350.345＞60182.94±0.632.56±1.356.3450.2251.84±1.337.7350.332≤60282.72±0.462.33±1.048.2310.1161.62±1.148.3520.225性别男202.89±0.686.5460.2562.69±1.227.7720.3321.79±1.354.2330.321女262.73±0.427.3360.3342.37±1.026.9840.3581.68±1.165.3280.327肿瘤直径（cm）≤2.0202.91±0.655.2330.3362.63±1.254.4420.3281.72±1.224.3290.228＞2.0262.74±0.447.8940.3422.34±1.143.5610.3341.66±1.049.4570.318肿瘤部位肝门部282.88±0.646.3420.2542.64±1.235.5560.2231.75±1.253.3360.257中、下段182.71±0.434.3520.5562.38±1.066.7240.3161.68±1.324.3520.334肿瘤分化高、中分化302.74±0.425.4360.2232.38±1.274.5630.2411.63±1.353.2680.226低分化162.86±0.636.1770.3162.64±1.025.6620.3251.73±1.244.5240.314 TNM分期Ⅰ期172.65±0.336.1320.2372.25±0.865.5570.0441.64±0.964.3520.032Ⅱ期152.76±0.414.3520.4322.36±0.936.3420.0351.72±1.135.4380.025Ⅲ期102.87±0.533.3160.5562.49±1.055.1160.0261.85±1.256.4430.012Ⅳ期42.98±0.624.3520.3262.62±1.146.4350.0161.94±1.386.4510.028

2.3 胆管癌组织claudin-18、maspin与p53表达的相关性分析胆管癌癌组织maspin表达与p53表达呈负相关（r=-8.546，P=0.001），而claudin-18表达与p53或maspin表达均无显著相关性（r=6.452，P=0.436，r=5.543，P=0.336）。

3 讨论

肿瘤的发生是一个渐进的过程，同时也是一个多因素、多阶段的过程，其中抑癌基因的失活是导致肿瘤细胞增殖、浸润和远处转移的基础[6]。目前已发现claudin蛋白已有27个家族成员，主要功能是维持细胞间粘附、调节细胞旁通透性及维持细胞极性[7，8]。近年来研究显示，不同claudin蛋白亚型在肿瘤中差异性表达可用于诊断及鉴别诊断，如claudin-4可用于鉴别腺癌，而尚不清楚claudin-18表达的作用[9，10]。本研究结果表明，claudin-18在胆管癌组织中的表达显著高于正常组，表明claudin-18可作为临床预测的指标之一。

Maspin是属于Serpin家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂，最初发现于正常人乳腺上皮，可编码42 kD细胞质蛋白。由于Maspin能够抑制乳腺癌细胞运动、侵袭和转移，因此被认为具有抑制肿瘤活性的能力[11-13]。p53是目前公认的maspin表达调节因子[14，15]，能够调控细胞的生长及DNA损伤后的细胞凋亡。p53有两种类型，分别为野生型和突变型。野生型p53可通过抑制细胞增殖、促进DNA损伤后的修复以及诱导细胞凋亡等方式起到抑制肿瘤生长的作用[16]；突变型p53因原有的空间构象已经改变，丧失了特异性结合DNA的能力，导致转录因子活性的丢失。除此之外，相关研究提示因突变型p53还能够与某些癌基因起协同作用，所以会促进肿瘤的增殖和生长[17]。由于野生型p53在细胞内的相对表达量较低且半衰期短，普通的免疫组化方法难以检测，而突变型P53因蛋白空间构象改变，半衰期较长，所以普通免疫组化方法所检测到的p53基本为突变型p53[18]。戚峰等[19]采用SP免疫组化法分别测定40例胆管癌组织和20例正常胆管组织p53的表达量，结果显示，胆管癌组织p53阳性率为57.5%，而正常胆管组织无p53阳性表达。这一结果表明，p53基因的突变或失活在胆管癌发生、发展的过程中起到了关键性的作用。本研究采用SP免疫组化法检测胆管癌组织p53的阳性率为56.52%，与戚峰等报道近似。Shinozaki et al[20]研究揭示p53能结合到maspin基因的启动子上，并把maspin视为p53的一个新的靶点。实验结果提示p53与maspin表达呈负相关，这与在胃癌、甲状腺癌、原发性前列腺癌、乳腺癌中的研究结果一致。本研究结果显示，胆管癌组织maspin表达与p53呈负相关，与Alvarez et al的研究结果一致。此外，本研究还发现，不同TNM分期的胆管癌组织maspin和p53表达量不同，暗示这两种指标可用于临床评价胆管癌患者病情的严重程度。

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（收稿：2016-09-27）

（本文编辑：陈从新）

Expressionofclaudin-18,maspinandp53intissuesfromcholangiocarcinoma

CaoGuangcai，Bai Jiangjiang，Dai Ali.Department of Anorectal Surgery，Affiliated Hospital，Yan'an University，Yan'an 716000，Shaanxi Province，China

ObjectiveTo study the expression of claudin-18，maspin and p53 in tissues of cholangiocarcinoma.MethodsThe expression of claudin-18，maspin and p53 were detected by immunohistochemistry and Western blot in 46 cholangiocarcinoma and 32 normal liver tissues.ResultThe positive rates of claudin-18 and p53 in cancerous tissues were 52.17%and 56.52%，respectively，significantly higher than 0.0%and 0.0%in normal control（P＜0.01）；The positive rate of maspin in cancerous tissues was 86.96%，much lower than 100.0%in normal control（P＜0.01）；The relative expression levels of claudin-18，maspin and p53 were 2.83±0.52，2.45±1.24 and 1.73±1.26，respectively，significantly higher than 0.48±0.75，0.46±0.32 and 0.0±0.0 in the control（P<0.05）；The expression of maspin was negatively correlated with p53 expression in cancerous tissues（r=-8.546，P=0.001）.ConclusionThe implication of maspin，claudin-18 and p53 expression in cholangiocarcinoma tissues needs further investigation.

Cholangiocarcinoma；Claudin-18；Maspin；p53；Immunohistochemistry；Western blot

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.03.014

716000陕西省延安市延安大学附属医院肛肠外科(曹光材,白江江）；陕西延安职业技术学院护理系（戴阿利）

曹光材，男，35岁，大学本科，主治医师。主要从事结肠直肠肿瘤和肛门良性疾病研究。E-mail：caoguangcai1981@163.com