DNA分子标记技术在石斛属鉴别中的应用进展

刘 枫，赵 群，戴 军，陈存武，陈乃富，韩邦兴

(1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；2.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230012；3.安徽省石斛产业化开发协同创新中心，安徽 六安 237012)

DNA分子标记技术在石斛属鉴别中的应用进展

刘 枫1，2，赵 群1，3，戴 军1，3，陈存武1，3，陈乃富1，3，韩邦兴1，3

(1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；2.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230012；3.安徽省石斛产业化开发协同创新中心，安徽 六安 237012)

DNA分子标记是基于物种间遗传物质差异的最直接反应，结果稳定可靠可以弥补传统中药鉴定中的不足。本文基于DNA测序分析和PCR方法的DNA分子标记技术的两个方面，对近些年石斛属的分子鉴别研究进行阐述。文献显示，在涉及石斛属鉴别的DNA序列片段中，以核基因组中的ITS序列、叶绿体基因组的matK、rbcL和psbA-trnH等基因片段应用较多；而在PCR的方法中，以SSR、RAPD、AFLP等标记技术相对普遍。本文通过对不同分子技术手段的比较，以期为其余石斛种的研究奠定基础，也为市场交易中石斛的鉴别提供参考资料。

石斛属；中药鉴别；DNA测序分析；PCR方法

石斛属Dendrobium为兰科大属，约有1 500余种，主要分布在亚洲、大洋洲等热带和亚热带地区，我国含有76种，包括2个变种[1](P153)，多作为观赏植物，部分也作药用石斛被收录于《中国药典》，具有益胃生津、滋阴清热等功效[2](P92)。现代研究发现，石斛中的石斛多糖、石斛碱等化学成分具有明显的药理活性，在抗氧化、抗肿瘤方面效果显著[3-4]。在该属中，物种在形态上极其相似，变异较小，多数种需在开花期才能进行准确的鉴别，且不同地方的同种石斛种内变异也较大，难以区分。而通过化学、显微等传统鉴别的方法虽然能够对部分石斛种进行鉴别[5]，但是费时费力，且结果易受材料的产地、采摘时期、储存条件的影响，具有一定的局限性。

近年来，各种分子生物学技术被广泛地运用于药用动植物的鉴别研究当中，如DNA barcoding，RAPD、AFLP、SSR等，由于结果稳定可靠且不受上述多种因素的影响，已成为中药鉴别研究中的热点而被普遍关注。分子鉴定主要是基于各物种间DNA序列上的碱基位点的差异，包括替换、缺失、插入等，有单个核苷酸位点的差异(SNPs)，也有序列长度的差异(ISSR、SSR等)，针对不同的变异类型设计相应的实验方法对疑难物种进行鉴别。目前，用于石斛属分子标记技术可分为两类：1)直接测序-基于DNA测序分析分子标记技术；2)基于PCR方法的DNA分子标记技术。在石斛属中，除了鉴别之外，分子技术在石斛育种、资源保护、遗传图谱构建等方面也常见报道[6]。

由于我国石斛药用历史悠久，但不同石斛所含化学成分可能有所不同，而部分伪品的出现为临床的药用安全带来了隐患。此外，石斛属中部分石斛(如霍山石斛D.huoshanense)价格昂贵，伪品的流通也使得消费者的财产遭受严重损失。因此，本文对石斛属的鉴别研究进行综述，通过不同分子技术手段的比较，以期为其余石斛种的研究奠定基础，也为实际交易中石斛的鉴别提供参考资料。

1 基于DNA测序分析分子标记技术

2003年，Hebert首次提出以一段DNA片段对物种进行鉴别。随后，多种DNA序列片段被作为潜在条形码应用到石斛属的鉴别当中，来源包括核基因rDNA、叶绿体基因cpDNA和线粒体基因mtDNA，涉及的候选片段有核糖体DNA中的LEAFY(LFY)同源基因[7]、ITS序列，叶绿体DNA中的编码基因matK、rbcL、rpoB、rpoC1、rps16和非编码区psbA-trnH、psbK-psbI[8]序列以及线粒体DNA中的nad1 intron2序列等。在石斛属中，以核糖体DNA中内间隔转录区ITS序列运用最多，其次为叶绿体基因cpDNA。

1.1 核糖体DNA

核糖体DNA位于细胞核内，可分为编码区(如5.8S、16S、18S等)和非编码区(如ITS序列)。但是，由于编码区受自然选择压力大，变异位点较少，具有高度保守性，难以作为石斛属分类鉴定的序列片段[9]。而nrITS序列(Internal Transcribed Spacer)为内间隔转录区，所受选择压力较小，目前已被广泛用于石斛属的鉴别研究，可见表1。石斛属物种繁多，分化时间较短，部分种尚未分化完全[10]，种间变异较少，在已报道的数据中，ITS序列虽然具有一定鉴别能力，但对于亲缘关系更近的石斛却无能为力。因此，黄海[11]建议采用不同目的序列的联合片段对石斛属进行DNA barcoding鉴定。Xu[12]通过对186种石斛1698条序列分析认为ITS+matK联合片段可作为石斛的核心条形码。Singh13]利用ITS、matK、rbcL、psbA-trnH、rpoB、rpoC1的单独序列和联合片段对36种石斛分析，结果表明，单一序列ITS、两片段联合matK+rbcL、三片段联合rpoB+rpoC1+matK在各水平中鉴别效率最高。

表1 ITS序列在石斛属鉴别中的应用

1.2 叶绿体DNA

叶绿体DNA为质体基因，多为单性遗传，在物种群体遗传及进化方面具有独特优势。此外，相对于核糖体DNA来说，质体基因多以单拷贝形式存在，无多倍体现象，在基因同源性上争论较少。石斛属cpDNA为闭合环状双链DNA，由一个大单拷贝区(Large single copy， LSC)、两个反向重复序列区(IRa和IRb)和一个小单拷贝区(Small single copy，SSC)组成。目前，运用较多片段也都分布在LSC区，如rbcL、matK、psbA-trnH等。

rbcL和matK同为编码基因。其中，rbcL基因编码1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶大亚基，长约1400 bp，但进化速率慢，较为适合亲缘关系较远或科级以上的研究。而matK基因编码络氨酸蛋白激酶，参与RNA转录中II型内含子的剪切，长度约为1.5 kb，被认为是cpDNA中编码基因进化速率最快的基因[22]。Asahina[23]用rbcL和matK基因对5种石斛进行区分，结果matK能够明显区分5种石斛，而rbcL区分效果不明显。YAO[24]利用rbcL基因可对市场上D.officinale的种苗及其伪品进行区分，但认为将rbcL作为石斛属的条形码仍需进一步的研究。但联合片段rbcL+matK对36种石斛鉴别的成功率为86.11%。由此可见，rbcL不适合作为单独序列对石斛属进行鉴别。然而，matK基因在不同研究中，结果差异较大[13]，因此，在能否作为石斛属的候选条形码仍需要深入研究。

psbA-trnH是cpDNA中psbA和trnH基因之间长度约300 bp的片段，由于位于非编码区，其进化速率大大快于rbcL和matK基因。邵世光[25]等构建15种枫斗类石斛的psbA-trnH数据库，并成功鉴定了待检种。YAO[26]等对17种石斛的psbA-trnH序列进行分析，结果发现种间变异系数为1.2%(0.3%～2.3%)，种内变异为0%～0.1%，认为psbA-trnH可作为石斛的鉴别条形码。但不足的是，psbA-trnH序列中存在的poly结构，导致扩增成功率较低，使其在鉴别中的应用受到限制[27]。

1.3 线粒体DNA

在动物的分子鉴别中，以线粒体基因COI作为通用条形码，但在植物中，线粒体基因进化速度慢，遗传分化小，而并不适用于植物。目前，也只有nad1 intron2(NADH脱氢酶亚基1编码基因内含子2)用于石斛属的鉴别中。张婷[28]等发现nad1 intron2中有17个变异位点，可以鉴别除D.loddigesii之外的其余8种石斛。随后，李国良[29]也利用nad1 intron2及其他联合片段对D.huoshanense和D.officinale展开了研究。

2 基于PCR方法的分子标记技术

聚合酶链式反应(Polymearse Chain Reaetion，PCR)是在体外进行的酶促合成特异性核酸片段的技术，基于PCR技术开发的各种分子标记方法也已广泛应用于中药的鉴定和多态性研究中[30]。目前，在石斛属中，以简单重复序列(Simple sequence repeats，SSRs)、随机扩增多态性DNA(Radom amplified polymorphic DNAs，RAPD)、扩增片段长度多态性DNA(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)等技术应用较为普遍。

2.1 微卫星标记DNA

微卫星DNA又称简单重复序列(Simple sequence repeats，SSRs)，由中央核心重复序列和两端侧翼序列组成，广泛的分布在真核生物的基因组中[31]。此外，在基于微卫星的基础上，又开发出一种新的ISSR(Inter-simple sequence repeats)技术，与SSR相同的是，都是基于基因序列中简单重复序列，依据高度的多态性，对物种进行遗传多样性分析和鉴别[32]。与RAPD、AFLP等技术相比，SSR和ISSR具有的多态性更丰富、更高。由于SSR和ISSR即具有特异性，又具有一定的种间通用性[33]。因此，在石斛属中，开发出来的SSR和ISSR分子标记可以在同属内通用，一定程度上节约了研究成本。

近年来，微卫星标记在石斛属中的应用越来越多，据统计，已有报道的就有D.huoshanense[34]、D.officinale[35]、D.nobile[36]、D.crystallinum[37]等。在石斛属的鉴别研究中，Shen[38]等从76条ISSR引物中挑选出10条对来自8个居群的铁皮石斛进行扩增，得到16条特异性条带可有效区别出不同居群的铁皮石斛。刘明珍[39]等为检测霍山石斛及其相似种之间的差异，先后利用ISSR分子标记技术构建研究石斛的指纹图谱，对霍山石斛及其相似种鉴别。除了鉴别之外，微卫星标记在石斛属的种质资源保护、遗传图谱构建和遗传多样性上也有较多应用[40-41]。

2.2 随机扩增多态性DNA

1990年，Welsh[42]提出RAPD分子标记技术，以不同基因组DNA作为模板，引入人工合成单随机寡聚核苷酸作为引物，进行聚合酶链式反应(PCR)，对扩增得到的不同长度目的片段，构建DNA指纹图谱，对近缘物种进行鉴别。由于事先不需知道模板DNA序列，且操作简单快捷、所需DNA量微少等特点，在石斛属中运用较多。目前，RAPD技术已在D.officinale、D.loddigesii、D.nobile等石斛属植物鉴别研究中得到应用。

张铭[43]等用对Dendrobium属的26个种进行了RAPD多态性分析，根据筛选到的特异性片段，将Sangon18引物从3’端延长至20 bp，设计成的特异性引物对D.officinale进行快速有效鉴别。此外，利用UPGAM聚类分析的方法对石斛属的鉴别研究也有较多报道。朱胜男[44]等用18条RAPD引物对31种石斛进行聚类分析，31种石斛形成7个分支，供试样品也完全被区分开。除了种间，较高多态性使得RAPD标记对于种内不同居群间的石斛也能够进行鉴别。尽管RAPD技术可以用于石斛属植物的物种鉴定和遗传多样性研究，但是由于RAPD技术结果重复性差等自身因素的限制，近些年来，在鉴别上应用也相对减少。

2.3 扩增片段长度多态性DNA

在RAPD技术提出之后，以分子杂交技术RFLP(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)和RAPD技术相结合的新型分子标记AFLP诞生。该技术既具有RFLP的稳定性，又具有RAPD的简便性，在多态性和重现性上都要比RAPD要高，因此，在指纹图谱构建和遗传多样性研究上也更广泛[45]。郑勇平等利用荧光AFLP技术对春石斛30个引进品种和杂交品种进行分析，并构建春石斛新品种的DNA指纹图谱[46]。Wang等利用3种组合引物扩增13种石斛的基因片段构建指纹图谱，并通过Nei相似性和UPGAM聚类分析，在得到346个片段中，有342个为多态性，多态性率为98.8%，为石斛的遗传关系和分类鉴别研究提供了有效的技术手段[47]。

除了上述常见方法之外，SSH-array、AP-PCR、ARMS、PCR-RELP、SCAR等基于PCR的分子标记技术也都相继用于石斛属的鉴别研究中。同时，各种新型DNA标记技术在石斛属中广泛应用也标志着分子鉴别在理论和方法学上的日益成熟。

3 总结与展望

现代分子生物学技术不仅能够对石斛进行准确的鉴别，弥补传统鉴别的不足，而且DNA分子标记也为石斛属的分子育种、种质保护等方面提供了新的技术手段。从文中可以看出，在目前石斛属的分子鉴别研究中，利用测序获得DNA目的片段的方法较为普遍，其中，以核糖体DNA中的内间隔转录区ITS序列应用最多，其次为叶绿体DNA，而在cpDNA中，蛋白编码的matK基因鉴别效果要高于其他叶绿体序列而备受青睐。此外，随着测序技术的进步，越来越多的基因序列被测出，从整个发展趋势来看，也由单一片段向多基因联合片段转换。在所有石斛属鉴别研究中，国内研究相对于国外要较多，且对于各种分子标记技术的在石斛属中的应用也走在国际前沿。但是，在整个的研究中，使用的基因片段仍旧多是CBOL和China Plant BOL Group提出的几种(ITS、matK、rbcL、psbA-trnH)[48]，新型片段的开发应用较少，对于部分疑难物种的鉴别依旧无法解决。而且，在一些研究中，对于实验结果的验证存在问题，多数实验缺乏大规模的样本检验。此外，在所综述的分子标记手段中，多数方法耗时耗力(如RAPD、AFLP等)，不利于推广和实际运用，为石斛属分子鉴别带来一定的限制。

因此，在今后的研究中，要注重新型片段的开发和样本量的提高，参考相似种石斛的研究结果，实现成果转移，节约实验成本。通过已经研究得到的实验结果，寻找特异性强的位点或片段，设计特异性引物，运用直观的检测方法，对石斛属进行鉴别，并且制定标准操作规程，实现分子鉴别的标准化。

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The Research Progress of Molecular IdentificationforDendrobiumSpecies

LIU Feng1,3, ZHAO Qun1,3, DAI Jun1,3, CHEN Cunwu1,3,CHEN Naifu1,3, HAN Bangxing1,3

(1.WestAnhuiUniversity,Lu’an237012,China；2.AnhuiUniversityofChineseMedicine,Hefei230012,China；3.SynergeticInnovationCenterofDendrobiaIndustrializationDevelopmentinAnhuiProvince,Lu’an237012,China)

DNA molecular marker technology is the essential response to the difference between species, the result is stable and reliable and make up for the deficiency of the traditional medicine identification. Therefore, this paper reviewed the research developments of identification ofDendrobiumspecies based on DNA sequences and PCR methods of DNA molecular biological technology. The existing documents revealed that DNA sequences used in identification ofDendrobiummainly include nuclear ITS, chloroplastrbcL,matK,psbA-trnH, and in the PCR molecular techniques, SSR, RAPD, AFLP are relatively common. The different molecular techniques are compared in order to lay the foundation for the research of otherDendrobiumspecies and provided the references for identification ofDendrobiumin practical trade.

Dendrobium; identification of TCM; DNA sequencing analysis; PCR methods

2017-02-14

国家林业行业标准制修订项目(2015-LY-152)；国家农业标准化示范区项目(SEQ8-109)；安徽省地方标准制修订项目([2014]162)；安徽省高校省级自然科学研究项目(KJ2013B329)。

刘枫(1992-)，男，安徽六安人，硕士研究生，研究方向：分子生药学。

R282.71

A

1009-9735(2017)02-0009-05