番茄中一个抗病基因功能的研究

许 伟, 苗 敏, 唐晓凤, 刘永胜

(合肥工业大学 食品科学与工程学院,安徽 合肥 230009)

番茄中一个抗病基因功能的研究

许 伟, 苗 敏, 唐晓凤, 刘永胜

(合肥工业大学 食品科学与工程学院,安徽 合肥 230009)

植物中最大的一类抗病基因(R)编码的蛋白质含有卷曲螺旋结构(coiled-coil,CC) 、核苷酸结合位点(nucleotide-binding site,NBS)和富含亮氨基酸的重复序列(leucine-rich repeat,LRR)结构域。R基因以抗病著称。文章通过酵母双杂筛选方式获得了DDI3基因,该基因与番茄中重要功能基因DDB1具有相互作用,而又含有CC-NBS-LRR结构,预测具有R基因抗病性,参与植物抗病。研究中构建了DDI3过表达载体并通过根瘤农杆菌介导转化到野生型番茄中,筛选获得DDI3高表达的阳性转基因株系。通过病菌接种实验,观察植株发病情况和统计细菌菌落数,结果发现,转基因植株的抗病性明显高于野生型番茄。DDI3基因对提高番茄的抗病性有很高的价值,为采用基因工程方法改良番茄植株抗病性做出新的尝试,同时又与番茄DDB1基因具有相互作用,对研究DDB1基因在参与植物抗病途径中的功能研究提供新的方向。

DDI3基因;CC-NBS-LRR结构域;转基因番茄;抗病性

自然界中真菌、细菌以及线虫引起的植物疾病对农作物生产带来了毁灭性的影响[1]。外界不良的环境以及各种病原菌通常会给植物生长发育造成一定伤害,同时植物在长期的进化过程中也形成了完善的自我保护机制，以抵御病原菌入侵以及外界不良环境的伤害。研究表明植物抗病R基因能够识别病原体引发的过敏性反应(hypersensitive response,HR),从而提高植物对病害的抵抗[2]。近年来,已经从不同的植物中克隆了多个R基因,其中多数的R基因都具有核苷酸结合位点(nucleotide binding site,NBS)和富含亮氨基酸的重复序列(leucine-rich repeat,LRR)结构域[3]。研究显示,NBS-LRR抗病基因主要编码3个结构域，即TIR(toll and IL-1 receptors)/CC(coiled-coil)、NBS和LRR,依据N端信号肽的不同,将NBS-LRR结构划分为以下2类结构：① 包括Toll/白细胞介素-1受体类似结构(TIR),形成结构TIR-NBS-LRR;② 不包括TIR结构域,但是一般被编码卷曲螺旋结构(CC)域所替代,形成CC-NBS-LRR结构[4]。

不同的NBS-LRR基因之间的核苷酸序列的差异性比较大,从而研究具有一定复杂性。但是已经在很多植物物种发现了CC-NBS-LRR的抗病基因,如小麦中Lr10抗叶锈病基因编码有3个结构域，分别为CC、NBS和LRR[5];水稻中相关研究比较广泛,研究主要集中在抗稻瘟病抗性基因。稻瘟病抗性基因Pik-p,通过RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术确定NBS-LRR结构具有抗病性[6];稻瘟病抗性Pi64基因在发育的所有时期和检测的组织中持续表达[7];BPH26是褐飞虱抗性26号基因,通过图谱定位克隆了BPH26基因,其中该基因编码了富含亮氨酸的核苷酸结构蛋白,BPH26被广泛纳入优良水稻品种[8];Pi54rh基因属于富含亮氨酸的核苷酸结构域R家族中的抗性基因,拥有独特的锌指结构域。Pi54rh基因在叶片中持续表达在正常的水平,但是接种病原菌96 h后表达量上调了3.8倍,具有明显的抗性上调[9];晚疫病是由致病疫霉菌引起的病害,是番茄中一类最具破坏性的病害。Ph-3是番茄中第1个被克隆出来的晚疫病抗性基因,并编码着富含亮氨酸的核苷酸结构蛋白[10]。

番茄是世界上第二大蔬菜作物,也是提取番茄红素等物质的重要原料,但是番茄生长发育过程受到各种病原菌侵害的制约[11]。番茄的病害主要有40多种,主要包括青枯病、早疫病、晚疫病、枯萎病、叶霉病等病菌[12]。

本研究通过酵母双杂的方法筛选到与番茄中重要DDB1基因有相互作用的DDI3,并利用番茄基因组信息确定了DDI3具有CC-NBS-LRR结构,功能预测具有抗病作用,因此确定了以DDI3基因为研究对象。克隆了番茄DDI3基因,重组到植物过表达载体中,通过重组质粒,在番茄野生型植株中过表达DDI3基因。采用农杆菌介导法对野生型番茄进行遗传转化,获得阳性转基因株系。通过在番茄幼苗上接种丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas.syringaepv.tomato,Pst),观察番茄植株病斑与生长状况,计算相同位置叶片1 cm2菌落数。比较发现,转基因苗与野生型AC苗的差异较明显,从而发现转基因植株DDI3过表达提高了番茄抗病性。

1 材料与方法

番茄(SolanumlycopersicumMill.cv.Ailsa Craig)、大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α菌株、丁香假单胞菌番茄致病变种Pst.DC3000(Pseudomonas.syringaepv.tomato)、农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株 EHA105及pBI121双元表达载体均为实验室保存。Trizol购自于Invitrogen、 反转录酶、Taq DNA 聚合酶、pEASY-Blunt载体、T4-DNA连接酶、限制性内切酶购自TaKaRa公司,质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自TIANGEN 公司。

1.1 番茄DDI3目的基因的克隆

按照Sol Genomics Network中番茄DDI3(Solyc05g008070.2.1)基因序列设计引物DDI3-F1、DDI3-R1、DDI3-F2、DDI3-R2,根据所构建目的载体上酶切位点,并运用软件Primer Premier 5对DDI3基因序列进行限制性内切酶位点分析,设计含SmaⅠ和XhoⅠ酶切位点的特异引物,见表1所列。

表1 本文研究所用的引物

提取野生型番茄幼苗总RNA,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增DDI3基因,PCR 条件如下:95 ℃预变性2 min;95 ℃ 20 s;51℃ 20 s;72 ℃ 160 s,32 个循环;72 ℃ 5 min,获取目的基因PCR产物。

1.2 DDI3双元过表达载体构建

将PCR 产物连接于pEASY-Blunt载体后转化到大肠杆菌DH5α中。对重组质粒进行菌落PCR和酶切鉴定,阳性克隆送南京金斯瑞生物技术服务有限公司测序,测序结果用DNAMAN软件进行分析。用SmaⅠ和XhoⅠ双酶切 pEASY-Blunt-DDI3重组质粒和pBI121-35S表达载体质粒,并胶回收目的基因片段和表达载体片段。将目的片段连接于pBI121-35S载体,连接产物转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中,筛选出阳性菌落,通过菌落PCR和限制性内切酶双酶切鉴定重组质粒[13]。

1.3 番茄的遗传转化及转基因植株的鉴定

根据文献[14-16],将重组pBI121-35S-DDI3质粒通过冻融法导入农杆菌EHA105,在含有利福平(Rifampicion,Rif)和卡那霉素(Kanamycin,Kana)各50 mg/L的培养基上28 ℃培养2 d,菌落PCR鉴定获取阳性菌株,并保存。

1.3.1 番茄发苗及获取愈伤组织过程

番茄种子用自来水浸泡12 h 后,用75%的酒精漂洗2 min,再用10% 次氯酸钠溶液浸泡消毒15 min,用无菌水漂洗8次后播种至1/2 MS培养基。22 ℃,暗培养4 d左右,露白后转至光照下培养。待子叶完全舒展开时,将子叶剪下后放置于预培养基MS+1 mg/L 6-BA(6-benzy lamino adenine,6-苄氨基腺嘌呤)+0.04 mg/L IAA (indoleacetic acid,吲哚-3-乙酸)培养2 d;将含有pBI121-35S-DDI3重组质粒的农杆菌28 ℃过夜培养后,室温下5 000 r/min离心5 min收集菌。

1.3.2 侵染过程与鉴定转基因阳性株系

用稀释后的农杆菌浸染预培养3 d的子叶10 min;用无菌滤纸吸去子叶上多余菌液后,将子叶转到共培养基MS+1 mg/L KT(kinetin,激动素)+1 mg/L 2,4-D(2,4-dichlo rophenoxyacetic acid,2,4-二氯苯氧乙酸)+10 mg/L ACE(acetosyringone,乙酰丁香酮)上培养2 d;然后转到筛选培养基MS+500 mg/L CB(carbenicillin,羧苄青霉素)+2 mg/L 6-BA+50 mg/L Kana+0.2 mg/L IAA上,22 ℃下光照培养(16 h 光照,8 h黑暗),每3周更换1次培养基;待愈伤组织上长出的不定芽长至2 cm左右时,将芽切下转移至生根培养基MS+500 mg/L CB+2 mg/L IAA+50 mg/L Kana上生根。待长出完整根系后移入营养土,放于温室中栽培。提取番茄基因组DNA,以DNA为模版,pBI121-35S质粒为阳性对照,同时用野生型番茄DNA作为阴性对照,根据pBI121 载体筛选标记基因新霉素磷酶基因(NPTⅡ)(GenBank登录号 AF485783)序列合成引物NPTⅡ-F 和NPTⅡ-R,对转基因植株进行PCR 鉴定。 PCR 反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s ，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s ，30个循环；最后72 ℃延伸5 min。

1.4 病菌接种

挑取Pst.DC3000单克隆,用含有利福平(Rif,50 mg/L)的LB液体培养液在28 ℃扩大培养48 h。将培养好的菌体离心,6 000 r/min离心4 min,除去上清。用灭菌好的10 mmol/L MgCl2溶液悬浮起菌体,使Pst.DC3000菌体均匀溶于MgCl2溶液中。测定菌体OD600 nm值,将菌体用10 mmol/L MgCl2液体稀释到OD600 nm=0.5,作为菌体接种浓度,正常情况1个OD600 nm=108～109cfu/mL。将长势基本相同的转基因番茄和野生型番茄,分别浸泡于OD600 nm=0.5的Pst.DC3000菌液中25 s,每组分别有5棵转基因苗和野生型苗作为实验组,未处理过的转基因和野生型番茄,作为空白对照组。处理过的番茄植株,72 h里套袋保持水分,并放置于人工培养室正常培养6 d,观察植株发病情况。

通过平板划线的方法计算接种病菌活体菌体数目。取100 μL的侵染病菌即OD600 nm=0.5,将其加入到900 μL灭菌的MgCl2溶液中,将菌体稀释了10倍。再从稀释混合均匀的菌体中取100 μL将其加入到900 μL灭菌的MgCl2溶液中,又将菌体稀释了10倍,依次将菌体稀释到10-4、10-5、10-63个梯度。从3个菌体溶液中分别取10 μL,用移液枪将其慢慢加到含有利福平(Rif,50 mg/L)的LB固体培养基上,让菌体沿着培养基流动,均匀涂于培养基上,放置于28 ℃恒温箱中生长2 d。从3个梯度中选择最理想的板子,计算菌落数,实验重复3次,计算平均值。

1.5 比较染病菌株叶片菌落数

取处理过6 d的转基因和野生型番茄植株,比较不同番茄植株相同位置1 cm2叶片菌落数量差异。取样过程中,选取转基因番茄与野生型番茄相同位置叶片,用打孔器钻取叶片上、中、下3个位置的圆孔样品(1 cm2)。加入1 mL 10 mmol/L MgCl2溶液,将叶片研磨均匀,转移到1.5 mL EP管中。用塑料棒均匀搅10 s,使每个EP管中叶片上菌落混合均匀。将菌体进行稀释,菌体稀释到10-2、10-32个梯度。分别取10 μL,用移液枪将菌液涂于含有利福平(Rif,50 mg/L)的LB培养基上,使菌体沿着培养基流动,均匀涂于培养基上。处理接菌的转基因叶片、接菌的野生型叶片、未接菌的野生型和转基因叶片4种样品,每组选取3棵不同番茄。实验重复3次,计算1 cm2叶片上的菌落数平均值,比较菌体数量差异。

2 结果与分析

2.1 DDI3基因与测序

以番茄cDNA为模板,用DDI3-F1和DDI3-R1为外侧引物PCR 扩增。再以PCR产物为模板,以DDI3-F2和DDI3-R2为内侧引物扩增,产物电泳检测结果如图1所示,图1中,扩增产物为一条特异条带,与预期的番茄DDI3基因片段2 511 bp大小一致。将其连接到pEASY-Blunt载体上,酶切鉴定正确,送测序。测序结果用DNAMAN和Chromas软件分析序列,与番茄DDI3基因在番茄基因组中序列一致。

图1 DDI3基因PCR扩增

2.2 表达载体鉴定

用SmaⅠ和XhoⅠ进行双酶切得到与预期结果大小一致2 511 bp的DDI3基因片段,证明DDI3基因已经连接到植物表达载体35S-pBI121上,如图2所示。

图2 pBI121-35S-DDI3载体双酶切鉴定结果

2.3 转基因植株的鉴定

植物组织培养获得转基因番茄株系,从叶片中提取转基因植株基因组DNA,利用植物表达载体pBI121 携带的NPTⅡ基因对植株进行阳性鉴定,预期扩增片段长度为 857 bp。共得到组培苗12株,其中6株经过鉴定为转基因番茄苗,结果如图3所示。图3表明,负对照野生型植株DNA未能扩增出857 bp 条带,而正对照35S-pBI121质粒和转基因株系DNA扩增出857 bp 条带,说明携带NPTⅡ基因的载体片段已整合于受体植株核染色体组中。

图3 转基因番茄植株的PCR鉴定

2.4 转基因植株的表型

DDI3转基因植株与野生型生长状况相比,没有明显差异,转基因植株果实颜色在成熟时期与野生型植株果实基本一致，虽然具有抗病CC-NBS-LRR结构,但未能改变番茄的表型性状。发苗实验中,在相同实验条件下,可以观察到相同生长期内DDI3转基因种子萌发速率要慢于野生型AC番茄种子。

2.5 接种Pst.DC3000的染病情况

通过稀释平板的方法,统计计算出接种的Pst.DC3000菌体浓度1个OD600 nm=2.78×108cfu/mL,菌体活性满足条件,具有很强的侵染活力。分别用Pst.DC3000处理转基因番茄和野生型番茄,发现处理6 d后,DDI3转基因番茄的病斑性状比较少,而野生型番茄病斑数目与生长状况有明显变化,如图4所示。相比之下,DDI3过表达的转基因番茄对Pst.DC3000具有一定的抵抗作用。

图4 番茄植株接菌发病情况

2.6 比较发病植株菌落数量差异

用打孔器钻取不同植株相同位置1 cm2叶片。将1 cm2叶片上的菌落均匀溶于灭菌的10 mmol/L MgCl2溶液中,通过稀释平板涂板的方法,计算出接菌DDI3转基因番茄与接菌野生型AC番茄的菌落数。选取稀释10-3为最宜计算值。为计算出更加准确的菌落数,吸取10 μL菌液沿着培养基从上往下流动,均匀涂于培养基上。每次3个重复,取平均值,减少实验误差。对5个独立的实验组进行分析比较,如图5所示,图5中,**表示高度显著;*表示具有差异。

图5 番茄菌落数比较图

由图5可以看出,野生型AC番茄叶片的Pst.DC3000菌落数目比较大,而DDI3转基因苗叶片菌落数目明显少于野生型。通过显著性差异分析,发现野生型菌落数是DDI3转基因苗的2.8倍,具有高度显著差异,如图6所示。说明DDI3转基因番茄上调表达对Pst.DC3000具有很好的抗病性。

图6 菌落数差异分析

3 结果与讨论

本文利用农杆菌侵染番茄愈伤组织获得DDI3的转基因番茄株系,观察发现DDI3的转基因番茄与野生型番茄无明显的差异。但是通过种子萌发实验可以发现DDI3萌发速度较慢,相同条件下,生长期内转基因种子萌发速率要慢于野生型AC种子,说明DDI3基因可能对番茄种子萌发有一定影响。

同时对DDI3转基因番茄进行抗病实验。通过接种Pst.DC3000病菌验证并计算番茄叶片的菌落数的发病情况,发现都有较明显的差异,从而确定DDI3转基因番茄对Pst.DC3000具有很好的抵抗作用,其抗病明显优于野生型番茄,说明过表达DDI3基因能提高番茄的抗病性。

目前本文只对DDI3转基因番茄植株抗病性进行研究,获得比较理想的实验结果。但是种子萌发实验的现象，本文未能具体分析产生萌发延迟和苗型生长较慢的原因。下一步将深入探究DDI3基因参与种子萌发机制,研究DDI3基因与种子萌发相关基因功能之间的联系,确定产生现象的原因与机理;后期还将对DDI3基因的抗病机制进行深入研究,并探究其抗病相关的上下游受体,阐述基因功能的作用机制及其与DDB1基因功能之间的关系,进一步为DDB1基因功能研究提供新的探究方向。

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(责任编辑 闫杏丽)

Research on one tomato gene involved in disease resistance

XU Wei, MIAO Min, TANG Xiaofeng, LIU Yongsheng

(School of Food Science and Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The proteins encoded by the biggest type of disease-resistant genes(R) in plants contain coiled-coil(CC) and nucleotide-binding site(NBS) and leucine-rich repeat(LRR) domain structure. R genes are famous for its disease resistance. In this paper,DDI3 gene was screened out by means of yeast two-hybrid, which had interaction with functionalDDB1 gene and contained the CC-NBS-LRR structure. It was predicted to have disease resistance of R gene and involved in plant disease resistance. TheDDI3 overexpression vector was constructed and transferred into the wild type tomato plants through agrobacterium-mediated transformation， and the positive transgenic plants with high expression ofDDI3 were obtained. By the pathogen inoculation experiment, the apparent plant disease and statistical number of bacterial colonies were observed. It is found that the resistance of transgenic plants is obviously higher than that of wild type tomato.DDI3 gene functioning as a resistance is a very good method to improve the disease resistance of tomato, which is a new attempt in the improvement of the disease resistance of tomato by using gene engineering technology.DDI3 also interacts with tomatoDDB1 gene, providing a new direction to the research on the function ofDDB1 in plant disease resistance.

DDI3 gene; CC-NBS-LRR domain; transgenic tomato; disease resistance

2016-01-25；

2016-04-18

国家自然科学基金资助项目(31171179)

许 伟(1989-),男,安徽芜湖人,合肥工业大学硕士生; 刘永胜(1964-),男,重庆市人,博士,合肥工业大学教授,博士生导师.

10.3969/j.issn.1003-5060.2017.04.022

Q78

A

1003-5060(2017)04-0547-06