高效液相色谱法测定禽蛋中苏丹红染料的方法研究

张鑫，李爱军＊，周鑫，肖琎，刘洋，杜瑞焕，齐彪，张立田，项爱丽，段晓然

（1.唐山市畜牧水产品质量监测中心 河北唐山 063000；2.唐山市机构编制电子政务中心 河北唐山 063000）

高效液相色谱法测定禽蛋中苏丹红染料的方法研究

张鑫1，李爱军1＊，周鑫1，肖琎1，刘洋1，杜瑞焕1，齐彪2，张立田1，项爱丽1，段晓然1

（1.唐山市畜牧水产品质量监测中心 河北唐山 063000；2.唐山市机构编制电子政务中心 河北唐山 063000）

本实验建立了禽蛋中苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ残留测定的高效液相色谱法，样品经正己烷提取浓缩

禽蛋；苏丹红染料；高效液相色谱法；固相萃取

苏丹红系列染料是一组人工合成的以苯基偶氮萘酚为主要 基 团的亲 脂 性偶氮 化 合物[1]，苏丹 红 I化学名 1- 苯基偶氮 -2- 萘酚，苏丹红 II化学名称为 1-[（2,4- 二甲基苯）偶氮]-2- 萘酚，苏丹 III 化学名称为 1-[4-(苯基偶氮)苯基]偶氮 -2- 萘酚，苏丹红 IV 化学名称 1-2- 甲基 -4-[（2- 甲基苯）偶氮]苯基偶氮 -2- 萘酚。因为其鲜艳的颜色且不易褪色，经常被不法分子作为染色剂添加进食品中。苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及其代谢产物有致癌性 ,因此我国在已经明 令 禁止 在 食品中 应用[2]。 但 仍有 一些 不法 分子在利益的驱使下，将苏丹红染料加入饲料中喂养家禽，以期得到所谓“红黄蛋”。国家已经出台针对食品中苏丹红染料的检测标准 GB/T 19681-2005《食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法》[3]。但是国标规定的方法操作复杂，对检测人员要求较高，并不适用于大量样品的检测。本文利用高效液相色谱法仪，建立了针对禽蛋中苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ检测的方法。本方法具有提取过程简单快捷，净化效果好，回收率高等特点，适用于禽蛋中苏丹红染料的检测。

1材料和方法

1.1 仪器

高效液相色谱仪，岛津公司 LC-20AT 配紫外检测器；电子天平，Sartorius 公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。

1.2 试剂

正己烷，HPLC 级，ACS 公司；乙腈，HPLC 级，ACS 公司；丙酮，HPLC 级，ACS 公司；苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ标准品，Dr.E；500mg/6 mL中性氧化铝固相萃取小柱，迪马科技。

1.3 实验方法

1．3．1 色谱条件 色谱柱为 LUNA C18 250mm×4.6 mm 5μm，流速为 1.0m L/min，检测波长：苏丹红Ⅰ、Ⅱ号检测波长为 478 nm，苏丹红Ⅲ、Ⅳ号检测波长为 520 nm。

色谱分离采用梯度洗脱的方式。流动相：溶剂 A为 0.1%甲酸水溶液∶乙腈为 85∶15，溶剂 B 为0.1%甲酸乙腈溶液∶丙酮为 80∶20。梯度条件：0～9min，流动相 A 保持 25%；9.01～20min，流动相 A从 25%下降到 0；20.01～25min，流动相 A 保持不变；25.01～30min，流动相 A 保持 25%。

1.4 样品处理：

称取 5 g 样品至50mL 离心管中，加入 15m L 正己烷，振荡 10min，5 000 r/min 离心 5min，收集上清液，重复提取1 次，合并2 次上清液，45 ℃减压旋蒸至干，用 5mL 正己烷溶解，备用。中性氧化铝固相萃取柱用 5m L 正己烷活化，5mL 溶解液全部过柱，10 mL 正己烷淋洗，5mL 5%丙酮正己烷溶液洗脱，氮吹至干，2mL 丙酮复溶，过 0.45μm 滤膜上机检测。

2 结果与讨论

2.1 最佳波长的测定

分别取苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号标准溶液于190～600 nm 波长范围内进行扫描,结果发现苏丹红Ⅰ、Ⅱ号最大吸收波长接近，苏丹红Ⅲ、Ⅳ号最大吸收波长接近，故而选择苏丹红Ⅰ、Ⅱ号检测波长为 478 nm，苏丹红Ⅲ、Ⅳ号检测波长为 520 nm。

2.2 提取溶剂选择

根据禽蛋类样品特点及文献[4-6]中提取方法，对正己烷、乙腈、正己烷 - 丙酮溶液三种提取液进行了比较，结果表明正己烷提取液和正己烷 -丙酮提取液提取回收率均比乙腈提取液高，且二者回收率相近，所以选择用正己烷做提取液。

2.3 固相萃取柱的选择和净化条件的确定

国标 GB/T 19681-2005《食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法》中使用中性氧化铝固相萃取柱对样品进行净化，但是国标中的中性氧化铝固相萃取柱手工填装，不容易把握填装量，氧化铝的活度也难以掌控，这直接影响检测结果。本方法对不同填料量的市售中性氧化铝固相萃取柱进行了比较，并且根据样品浓缩后复溶液体积为 5mL，所以最终选择 500mg/6mL 的中性氧化铝固相萃取柱。

图1 苏丹红混合标准溶液色谱图

图2 空白加标色谱图

图3 空白样品色谱图

中性氧化铝固相萃取柱的属于正相柱，选择了丙酮 -正己烷溶液作为洗脱液，并且根据丙酮浓度做了淋洗曲线，发现 5%丙酮正己烷溶液（体积比）就能完全洗脱苏丹红，所以选择了 5%丙酮正己烷溶液（体积比）作为洗脱液。

图4 淋洗曲线

2.4 线性范围及最低检测限

配 制 浓 度 分 别 为 0μg/mL、0.1μg/mL、0.5 μg/m L、1.0 μg/mL、5.0 μg/m L、10.0 μg/mL 苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号混合标准溶液，并进行色谱分析，以苏丹红含量 Y（μg/mL）对峰面积 X 作图，得出苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号的标准曲线，回归方程及相关系数见表1。

表1 苏丹红的回归方程及相关系数

2.5 方法测定低限的确定

对空白样品进行 20 次重复测定，按照 3 倍信噪比计算，得出方法测定低限均为 10μg/kg。

2.6 精密度回收率

对加标回收实验，加标浓度分别为 10μg/kg、20μg/kg、100μg/kg，即为方法测定低限、两倍方法测定低限和十倍方法测定低限，依照样品处理方法测定，回收率及相对偏差见表。从表可见，3 个加标浓度的苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号均有良好回收率和相对偏差。

表2 苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号的加标回收率和相对偏差

3 小结

本方法对禽蛋中苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号的检测方法进行了研究，通过对提取液、固相萃取条件的优化，得到了满意的分离效果。本方法具有操作简便快捷，灵敏度高，线性范围宽等特点，完全能够满足禽蛋中苏丹红染料检测的需要。

[1]黄曙海等. 苏丹红染料毒性研究及食品中苏丹红检测方法简述[J].广西预防医学,2005(11):380-383.

[2] (5)卫生部.中华人民共和国卫生部公告,苏丹红危险性评估报告[R].2015.

[3]国 家质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局, 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会.GB/T 19681-2005. 食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法[S].2005-03-29

[4]吴银良等,固相萃取高效液相色谱法测定辣椒油中苏丹红和对位红染料.食品科学，2009(30):243-246.

[5]金海涛等, 高效液相色谱法测定鸡蛋中苏丹红的检测方法.现代科学仪器，2009(6):101-103

[6]冯辉等, 固相萃取 - 高效液相色谱法测定鸡蛋中苏丹红染料.现代农业科技，2015(14):291-293.

（配图来自网络）

10.3969/j.issn.1008-4754.2017.02.043

*通讯作者：李爱军。

张鑫（1983-），女，河北唐山人，硕士研究生，从事动物营养与饲料科学研究。

后，用中性氧化铝固相萃取柱净化，高效液相色谱分离测定。四种苏丹红染料浓度在 0～10μg/m L 范围内与峰面积呈线性相关，相关系数均在 0．9998 以上。低、中、高 3 个加标水平的回收率在 73．04%～96．79%之间，相对偏差为 0．98%～5．89%。本方法操作简便快捷，灵敏度高，线性范围宽，适用于禽蛋中苏丹红染料检测。