前列腺素E1预处理对胆汁淤积大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用

徐 锋， 刘晓琳， 王 超， 戴朝六

(中国医科大学附属盛京医院 肝胆脾外科， 沈阳 110004)

前列腺素E1预处理对胆汁淤积大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用

徐 锋， 刘晓琳， 王 超， 戴朝六

(中国医科大学附属盛京医院 肝胆脾外科， 沈阳 110004)

目的 探讨前列腺素E1(PGE1)对胆汁淤积肝脏缺血再灌注损伤的保护机制。方法 36只雄性Wistar大鼠随机分为前列腺素E1组(PGE组)和生理盐水组(NS组)。PGE组肝缺血前15 min至再灌注60 min经门静脉持续泵入PGE1(0.5 μg·kg-1·min-1)，NS组给予等量生理盐水。结扎胆总管，建立胆汁淤积模型。7 d后Pringle法阻断入肝血流15 min，于再灌注1、6和24 h，检测血清生化酶和胆红素，以及肝组织髓过氧化物酶(MPO)、TNFα、Bcl-2、Bax、热休克蛋白(HSP)70和病理组织学改变。结果 再灌注1、6和24 h，2组TBil和DBil水平比较，差异均无统计学意义(P值均>0.05)。再灌注1、6和24 h，PGE组ALT、AST、MPO和TNFα水平均显著低于NS组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。再灌注1、6和24 h，PGE组Bcl-2水平显著高于NS组，Bax水平显著低于NS组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。再灌注1 h和6 h，PGE组HSP70 mRNA表达水平明显高于NS组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。再灌注24 h，2组HSP70 mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。PGE组肝组织损伤程度均较NS组轻，表现为肝细胞肿胀减轻，肝细胞坏死减少，肝细胞索及肝窦结构比较清晰，肝细胞索排列较规则，肝窦明显增宽。结论 PGE1通过减少中性粒细胞浸润和Bax表达，以及增强HSP70和Bcl-2表达保护胆汁淤积肝脏的缺血再灌注损伤。

胆汁淤积； 再灌注损伤； 前列地尔； 大鼠, Wistar

恶性胆道梗阻根治性手术有时需联合切除部分肝脏，入肝血流阻断是切肝时常用的控制术中出血的方法，随之难免会引起肝脏缺血再灌注损伤。胆汁淤积会导致肝脏微循环障碍和缺血再灌注前后的能量代谢异常，加重肝损伤[1]。如何减轻胆汁淤积肝脏的缺血再灌注损伤一直是困扰肝脏外科医生的一个难题。尽管动物实验证实术前胆道引流能够减轻缺血后肝脏再灌注损伤[2]，但荟萃分析显示术前胆道引流并没有提高恶性胆道梗阻患者术后疗效和安全性[3]。因此，术前是否减黄至今仍存在争议。

药物预处理则被证明是一种有效的防护手段。前列腺素E1(prostaglandin E1, PGE1)具有扩张血管、抗血小板聚集等作用，能够改善肝脏的微循环，增加其能量代谢和胆汁的分泌，能够防护肝脏缺血再灌注损伤[4]。但其在胆汁淤积肝脏缺血再灌注损伤中的防护机制尚未阐明，本研究就此机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料 雄性Wistar大鼠36只，清洁级，体质量(270±20)g，购自中国医科大学附属盛京医院动物实验中心。PGE1购自北京赛生药业有限公司。髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。TNFα ELISA试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。Bcl-2和Bax一抗购自SANTA CRUZ生物技术有限公司。即用型SP免疫试剂盒(SP9000)和DAB显色试剂盒购自中国北京中山生物技术有限公司。逆转录PCR(RT-PCR)试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 动物模型制备及分组 用随机数字表法将大鼠随机分为PGE1组(PGE组)和生理盐水组(NS组)，各组再随机分为再灌注1、6和24 h亚组。参照文献[5]将胆总管结扎后切断，喂养1周，建立胆汁淤积肝脏模型。造模结束后离断肝周韧带，肝脏缺血前PGE组经门静脉持续泵入PGE1(0.5 μg·kg-1·min-1)15 min，NS组给予等量生理盐水。用无创伤动脉夹Pringle法完全阻断入肝血流，15 min后恢复肝脏血供。于再灌注期间持续泵入PGE1或生理盐水 60 min，并建立胆道内引流：将一外径0.9 mm硬膜外导管插入胆总管，另一端插入十二指肠。分别于再灌注1、6和24 h时取腹主动脉血，静置，离心，将血清置于-20 ℃冰箱保存，待测生化酶及胆红素水平。取左外叶肝组织置于10%中性甲醛溶液固定，待做病理检测。取右叶肝组织，置于液氮，再转至-80 ℃冰箱保存，待测肝组织MPO、TNFα、Bcl-2、Bax和热休克蛋白(heat shock protein,HSP)70。

1.3 血清生化酶和胆红素检测 用全自动生化分析仪检测血清TBil、DBil、ALT和AST，由中国医科大学附属盛京医院检验科协助完成。

1.4 肝组织病理检测 肝组织块常规石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察肝脏病理组织学改变。

1.5 免疫组化检测Bcl-2和Bax表达 取10%甲醛溶液固定的肝组织块，石蜡包埋，常规4 μm切片，采用SP法测定肝组织中Bcl-2和Bax表达。兔抗鼠Bcl-2和Bax单克隆抗体均按1∶75稀释，DAB显色，苏木素复染，树胶封片。细胞浆出现棕黄色颗粒判断为Bcl-2、Bax阳性表达细胞。用OLYMPUS-B5X型显微镜及图像分析系统扫描，400倍镜下随机选择5个视野采集图像，用图像分析软件进行分析，测Bcl-2和Bax表达积分光密度值。

1.6 肝组织MPO活力检测 称取质量<100 mg的肝组织块，冰水中匀浆，制成5%肝组织匀浆，4 ℃，16 000 r/min离心10 min，按照试剂盒说明书操作，用紫外分光光度计460 nm测定其吸光度，检测MPO活力。1.7 ELISA检测TNFα表达 称取质量<100 mg的肝组织，冰水中匀浆，16 000 r/min离心10 min，取上清液。建立TNFα标准曲线，在每一待测品孔加样品100 μl，混匀后37 ℃水浴120 min。洗涤5次，每孔加一抗50 μl，37 ℃水浴60 min。洗板后每孔加酶标抗体100 μl，37 ℃水浴60 min。洗板后每孔加底物100 μl，暗处37 ℃反应10 min后加终止液。用全自动酶标仪492 nm测定吸光值及TNFα水平。

1.8 RT-PCR检测肝脏HSP70 mRNA表达 称取0.5 g肝组织，加TRIzol提取总RNA。采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取RNA的质量。用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。将样本RNA稀释成为1 μg/μl，置于-80 ℃冰箱保存。RNA逆转录合成cDNA按照试剂盒说明书操作。采用PCR反应体系来检测目的基因的表达情况。引物设计通过美国国立图书馆Medline基因库进行基因检索，由北京三博远志生物技术有限责任公司协助合成。HSP70：上游引物，5′-GCGGGATGTATCGGGTTC-3′；下游引物，5′-TGGACAGGGAGTGCTTGG-3′。β-actin：上游引物，5′-CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC-3′；下游引物，5′-CCACACAGATGACTTGCGCTCAGG-3′。将2 μl经逆转录合成的cDNA加入25 μl PCR反应体系内，95 ℃变性，55 ℃退火，72 ℃延伸，HSP70循环35个周期，β-actin循环30个周期。所有标本都重复检测3次。以β-actin作为内对照扩增，在2%的琼脂糖溴化乙锭凝胶上电泳，扫描测定PCR产物带密度，对比HSP70产物带和β-actin产物带密度值，相对定量HSP70基因表达水平。

2 结果

2.1 血清TBil、DBil、ALT和AST水平 再灌注1、6和24 h，PGE组TBil、DBil水平与NS组比较，差异均无统计学意义(P值均>0.05)。再灌注1、6和24 h，PGE组ALT和AST水平均显著低于NS组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)(图1)。

图1 PGE组和NS组血清胆红素和生化酶水平

2.2 肝组织病理形态学观察 NS组再灌注1 h，肝细胞肿胀，肝窦变窄，肝细胞索和肝窦分界不清，中性粒细胞浸润增加，肝窦内大量中性粒细胞聚集；尤其是再灌注6 h，肝组织结构更加紊乱不清，中央静脉周围出现大量坏死的肝细胞；再灌注24 h，肝细胞肿胀稍有减轻，肝窦间隙稍有增宽。PGE组再灌注不同时间点肝组织损伤程度均较NS组轻，表现为肝细胞肿胀减轻，肝细胞索及肝窦结构比较清晰，肝细胞索排列较规则，肝窦明显增宽；尤其是再灌注6 h，肝细胞坏死明显较少(图2)。

图2 PGE组与NS组肝组织形态学改变(HE染色，×400) a：NS组再灌注1 h；b：PGE组再灌注1 h；c：NS组再灌注6 h；d：PGE组再灌注6 h；e：NS组再灌注24 h；f：PGE组再灌注24 h

2.3 肝组织Bcl-2和Bax表达 再灌注1、6和24h，PGE组肝组织Bcl-2表达水平均显著高于NS组，平均积分光密度分别为10.259±3.516 vs 3.133±0.588、13.542±1.682 vs 8.172±1.124和6.952±1.419 vs 2.028±0.738；t值分别为3.462、4.598和5.332；P值分别为0.026、0.010和0.006。PGE组Bax 表达水平均显著低于NS组，平均积分光密度分别为6.196±1.827 vs 9.835±1.226、7.515±2.179 vs 13.943±3.145和10.375±2.408 vs 16.867±2.943；t值分别为2.865、2.910和2.957；P值分别为0.045、0.043和0.041(图3，4)。

图3 PGE组与NS组Bcl-2表达情况 a：NS组再灌注1h；b：PGE组再灌注1h；c：NS组再灌注6 h；d：PGE组再灌注6 h；e：NS组再灌注24 h；f：PGE组再灌注24 h

图4 PGE组与NS组Bax表达情况 a：NS组再灌注1 h；b：PGE组再灌注1 h；c：NS组再灌注6 h；d：PGE组再灌注6 h；e：NS组再灌注24 h；f：PGE组再灌注24 h

2.4 肝组织MPO水平 再灌注1、6和24 h，PGE组肝组织MPO水平均显著低于NS组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)；且再灌注6 h肝组织MPO水平达峰值，此后2组MPO水平均有下降趋势(P值均<0.05)(图5)。

2.5 肝组织TNFα水平 PGE组再灌注1、6和24 h肝组织TNFα水平均显著低于NS组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。再灌注6 h，2组肝组织TNFα水平达峰值，再灌注24 h时2组TNFα水平均有显著下降(P值均<0.05)(图6)。

图5 PGE组与NS组肝组织MPO表达水平

图6 PGE组与NS组肝组织TNFα表达水平

2.6 肝脏HSP70 mRNA表达 再灌注1 h和6 h，PGE组HSP70 mRNA表达水平明显高于NS组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。再灌注24 h，2组HSP70 mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。PGE组HSP70 mRNA表达水平随再灌注时间延长呈逐渐下降趋势(图7)。

图7 PGE组与NS组肝组织HSP70 mRNA表达水平

3 讨论

胆汁淤积肝脏缺血再灌注损伤是肝脏外科时常面临的一个重要临床问题。缺血再灌注损伤不但会引起术后肝功能不全甚至衰竭，而且还能促使肿瘤发生肝转移[4,6-7]。如何减轻缺血再灌注对胆汁淤积肝脏的损伤对提高恶性胆道梗阻肝切除患者的生存率具有重要作用。本研究旨在通过PGE1预处理来防护胆汁淤积肝脏的缺血再灌注损伤，以期为临床提供一种可行的方法。

研究结果显示：缺血再灌注后血清生化酶ALT和AST呈进行性升高，肝细胞损伤进行性加重，再灌注6 h达峰值，再灌注24 h肝组织损伤逐渐恢复。PGE1预处理能显著降低再灌注后血清ALT和AST水平，减轻肝细胞损伤，改善肝组织病理改变。众所周知，ALT和AST是评价肝细胞损伤程度的常用指标。肝脏缺血再灌注时ALT水平与肝细胞坏死程度和范围呈正相关，尤其在再灌注24 h时二者相关性更加明显[8]。本研究结果也进一步证实了ALT水平与肝细胞坏死程度的相关性，说明PGE1预处理对胆汁淤积肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用。其保护机制与以下因素有关：

(1)减少肝脏中性粒细胞浸润。MPO是反映中性粒细胞浸润较为敏感的指标。TNFα则是浸润的中性粒细胞释放的一个重要细胞因子[9]。本研究结果显示，再灌注后NS组肝组织MPO和TNFα表达水平均明显增加，至再灌注6 h达峰值。这提示缺血再灌注后肝脏中性粒细胞浸润增加。肝组织病理也证实肝窦内大量中性粒细胞聚集。PGE1预处理后MPO和TNFα表达水平均显著下降，说明PGE1能够减少中性粒细胞浸润。这与先前研究[10]结果吻合。PGE1可通过抑制血小板聚集，改善微循环[11]；抑制肝窦内皮细胞分泌血管细胞黏附分子-1、细胞间黏附分子-1、P选择素和E选择素表达，从而抑制中性粒细胞-内皮细胞的相互作用，减少中性粒细胞与肝窦内皮细胞黏附和渗出[4,12]。还能抑制TNFα等炎性细胞因子释放[11-12]。进而减少TNFα介导NF-κB或PGC-1α/Mfn2信号通路引起的肝损伤[13-14]。

(2)提高肝组织对缺血再灌注损伤的应激能力。本研究结果显示，PGE1预处理能显著提高缺血再灌注后肝组织HSP70 mRNA表达。有研究表明，HSP70 mRNA和蛋白在正常细胞和非缺血肝组织都检测不到，只有在应激状态下(如温度升高、缺血再灌注、TNFα、内毒素和急性炎症等)才能大量产生。HSP70 mRNA表达要先于HSP70蛋白，前者在肝缺血早期即有表达，再灌注后表达增强；而且随着缺血时间延长、损伤加重，其表达也增强；随着肝损伤逐渐修复，其表达也逐渐消退。HSP70蛋白直到再灌注12 h才能检测到，48～72 h达高峰[15-16]。HSP70能作用于Kupffer细胞，抑制其产生活性氧自由基，或是通过抑制氧自由基关键酶NADPH 氧化酶，减少活性氧族的产生，增强肝细胞耐受力[17-18]。HSP70还能与缺血再灌注时产生的未折叠或变性蛋白结合，使其维持肽链伸展状态，防止错误折叠聚集，恢复正确的折叠，对无法挽救的变形蛋白加速降解清除，保持肝细胞内稳态，减少肝细胞损伤破坏[19]。

(3)减少肝组织Bax表达，增强Bcl-2表达，减少肝细胞凋亡。本研究结果显示，PGE组相对于NS组再灌注后肝组织致凋亡蛋白Bax表达减少、抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加，说明PGE1预处理能减少肝细胞凋亡。当肝脏缺血再灌注时Bax表达被激活，导致羧基末端区域外露，与线粒体外膜结合，进一步促使线粒体释放caspase3和凋亡诱导因子等[20]。Bax还能与Bcl-2形成异源二聚体，促使内质网释放Ca2+，与细胞色素C相互作用激活caspase信号转导通路，产生凋亡小体，诱导凋亡形成[21]。Bcl-2作为抗氧化物则能调节细胞的氧化还原状态，阻止细胞成分发生氧化损伤和DNA断裂，保护细胞核免于损伤；此外，还可以影响细胞膜转运，改变Ca2+分布，抑制线粒体释放细胞色素C[22]。从而抑制肝细胞凋亡的发生。

总的来说，PGE1通过减少肝内中性粒细胞浸润和Bax表达，增强HSP70和Bcl-2表达，对胆汁淤积肝脏缺血再灌注损伤起到了保护作用，但其更深入的作用机制有待进一步研究。

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引证本文：XU F, LIU XL, WANG C, et al. Protective effect of prostaglandin E1 pretreatment against liver ischemia-reperfusion injury in rats with cholestasis[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(5): 899-904. (in Chinese) 徐锋， 刘晓琳， 王超， 等. 前列腺素E1预处理对胆汁淤积大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 临床肝胆病杂志, 2017, 33(5): 899-904.

(本文编辑：朱 晶)

Protective effect of prostaglandin E1 pretreatment against liver ischemia-reperfusion injury in rats with cholestasis

XUFeng,LIUXiaolin,WANGChao,etal.

(DepartmentofHepatobiliaryandSplenicSurgery,ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,China)

Objective To investigate the protective mechanism of prostaglandin E1 (PGE1) against liver ischemia-reperfusion injury in rats with cholestasis. Methods A total of 36 male Wistar rats were randomly divided into PGE1 group (PGE group) and normal saline group (NS group). The rats in the PGE group were treated with continuous pump of PGE1 (0.5 μg/kg/min) from 15 minutes before liver ischemia to 60 minutes of reperfusion, and those in the NS group were given normal saline of the same volume. Common bile duct ligation was performed to establish a rat model of cholestasis. Seven days later, Pringle maneuver was used to perform hepatic inflow occlusion for 15 minutes, and serum levels of enzymes and bilirubin were measured at 1, 6, and 24 hours of reperfusion, as well as the levels of myeloperoxidase (MPO), tumor necrosis factor α (TNFα), Bcl-2, Bax, and human heat shock protein 70 (HSP70) and histopathological changes. Results At 1, 6, and 24 hours of reperfusion, there were no significant differences in total bilirubin and direct bilirubin between the two groups (bothP>0.05), and the PGE group had significantly lower levels of alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, MPO, and TNFα than the NS group (allP<0.05). At 1, 6, and 24 hours of reperfusion, compared with the NS group, the PGE group had a significantly higher level of Bcl-2 and a significantly lower level of Bax (both P <0.05). At 1 and 6 hours of reperfusion, the PGE group had significantly higher mRNA expression of HSP70 than the NS group (P<0.05), and at 24 hours of reperfusion, there was no significant difference in mRNA expression of HSP70 between the two groups (P>0.05). Compared with the NS group, the PGE group had a lower degree of liver injury, which manifested as reduced hepatocyte swelling and necrosis, clear structures of the hepatic cords and the hepatic sinusoids, regular arrangement of hepatic cords, and widened hepatic sinusoids. Conclusion PGE1 protects the liver with cholestasis against ischemia-reperfusion injury by reducing neutrophil infiltration and Bax expression and upregulating the expression of HSP70 and Bcl-2. Key words：cholestasis； reperfusion injury； alprostadil； rats, wistar

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.05.022

2016-10-20；

2016-12-05。

辽宁省自然科学基金项目(2013021068)

徐锋(1976-)，男，副教授，博士，主要从事肝胆胰疾病基础与临床研究。

戴朝六，电子信箱：daicl@sj-hospital.org。

R575

A

1001-5256(2017)05-0899-06