化痰祛湿活血方对非酒精性脂肪性肝炎大鼠ADPN/AMPK/ACC通路的影响

赵文霞， 闫 乐， 邵明义， 张丽慧

(河南中医药大学第一附属医院 脾胃肝胆病科， 郑州 450000)

化痰祛湿活血方对非酒精性脂肪性肝炎大鼠ADPN/AMPK/ACC通路的影响

赵文霞， 闫 乐， 邵明义， 张丽慧

(河南中医药大学第一附属医院 脾胃肝胆病科， 郑州 450000)

目的 研究化痰祛湿活血方对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠脂联素(ADPN)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/乙酰辅酶A羧化酶(ACC)通路的影响。方法 72只SD大鼠随机分为空白组、模型组、对照组及高、中、低剂量组，除空白组外，其余5组以高脂饲料联合四环素腹腔注射建立NASH模型，造模第2周分别给予化痰祛湿活血方高、中、低剂量和多烯磷脂酰胆碱(易善复)胶囊对照治疗。实验结束时，观察肝匀浆游离脂肪酸(FFA)含量，ELISA及RT-qPCR法测肝组织ADPN、脂联素受体2(AdipoR2)、AMPK、ACC、肉毒碱棕榈酰转移酶1(CPT-1)的基因与蛋白表达。多组间数据比较采用方差分析，方差齐者进一步两组间比较采用LSD-t检验，方差不齐者采用Dunnett′s T3法。结果 与对照组比较，高剂量组能明显降低肝匀浆FFA[(229.07±46.62) μmol/gprot vs (382.75±30.93) μmol/gprot]、肝组织ACC的基因(1.66±0.04 vs 2.40±0.37)、蛋白[(512.20±60.70) pg/g vs (756.72±61.21) pg/g]表达(P值均<0.01)，升高ADPN、AdipoR2、AMPK、CPT-1的基因[1.53±0.31 vs 0.75±0.11,1.38±0.33 vs 0.61±0.09,1.43±0.39 vs 0.78±0.04, 1.39±0.31 vs 0.52±0.04]、蛋白[(22.23±2.75) μg/g vs (14.01±2.17) μg/g, (128.41±10.46) ng/g vs (94.62±6.88) ng/g,(1353.79±59.52) μg/g vs (1107.19±56.78) μg/g,(175.54±9.91) U/g vs (128.74±12.74)U/g]表达(P值均<0.01)。结论 化痰祛湿活血方能够有效激活ADPN/AMPK/ACC信号通路，影响脂肪酸的β氧化及合成，减少肝细胞脂肪沉积。

非酒精性脂肪性肝炎； 化痰祛湿活血方； 脂联素； 腺苷酸活化蛋白激酶； 乙酰CoA羧化酶

随着人们膳食结构及生活方式的改变，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的患病率明显上升，已成为21世纪全球重要的公共健康问题之一[1-2]。由于非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是NAFLD向肝纤维化、肝硬化发展的重要环节，防治NASH的发生，对于阻断其向肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌的发生具有重要意义。脂联素(adiponectin,ADPN)作为脂肪细胞分泌的具有良性调节作用的脂肪细胞因子，其作用机制在于调控ADPN/腺苷酸活化蛋白激酶(amp-activated protein kinase,AMPK)/乙酰辅酶A羧化酶(acetyl coenzyme A,ACC)信号通路，参与糖脂代谢、炎症等病理生理过程，具有胰岛素增敏、抗高血糖、抗动脉粥样硬化等作用，是脂肪代谢过程中重要的细胞因子[3]。

笔者团队前期临床研究[4]显示，具有化痰祛湿活血作用的消脂护肝胶囊能够降低NASH患者血清ALT、AST、TG水平，以及胰岛素抵抗和瘦素水平。动物实验[5-6]表明，化痰祛湿活血方能够升高ADPN、脂联素受体2(adiponectin receptor-2,AdipoR2)蛋白表达，降低血清ALT、AST、TG、TC 水平，减轻肝组织脂肪沉积及炎症程度。该方通过细胞实验可达到调控ADPN/AMPK/ACC信号通路，增强AMPK mRNA和CPT-1 mRNA的表达，降低ACC mRNA的表达的作用[7]。为探讨化痰祛湿活血方干预NASH模型大鼠体内ADPN/AMPK/ACC信号通路作用机制开展了本研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠72只，雄性，体质量(200±10)g，鼠龄6周，SPF级，河南省实验动物中心提供。动物合格证号：0008435。

1.1.2 实验药物 化痰祛湿活血方颗粒剂由四川新绿色药业科技发展股份有限公司制备，为免煎颗粒(泽泻30 g、海藻15 g、决明子10 g、郁金15 g等)。多烯磷脂酰胆碱胶囊(易善复)由赛诺菲安万特(北京)制药有限公司生产，批号：D2105。

1.1.3 主要试剂 盐酸四环素：Amresco；胆固醇：Sorlarbio；脂肪酸(free fatty acid ,FFA)试剂盒(南京建成科技有限公司生产)；大鼠ADPN、AdipoR2、AMPK、ACC、肉毒碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmitoyl transterase-1,CPT-1)ELISA试剂盒(上海拜沃生物科技有限公司提供)；TRIzol总RNA抽提试剂(购自Invitrogen)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(购自Thermo公司)；UltraSYBR Mixture(With ROX)试剂盒(购自北京康为世纪生物科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立 72只SD大鼠随机分为6组，每组12只，分别为空白组、模型组、对照组及高、中、低剂量组。按照参考文献[5，8-9]，空白组给予普通标准饲料，其余5组均给予高脂饲料(84%基础饲料+10%猪油+5%蛋黄粉+1%胆固醇)。于造模第1天腹腔注射四环素10 mg/100 g体质量，1周后每6天1次腹腔注射盐酸四环素7 mg/100 g体质量，共计6次。每周称1次体质量，并按体质量相应调整给药量。造模时间共计6周，实验期间中剂量组大鼠死亡2只。1.2.2 给药方法 自造模第2周起，除空白组外，各组均按1 ml·100 g-1· d-1分别灌服生理盐水及相应药物；对照组将多烯磷脂酰胆碱胶囊超波振荡溶于蒸馏水中，制成浓度为28.5 mg/ml的混悬液。该方颗粒剂按高、中、低剂量配成浓度为5.04 g/ml、2.52 g/ml、1.26 g/ml的悬液(相当于临床等效剂量的2倍、1倍、0.5倍)；模型组灌服同体积的生理盐水。各组大鼠灌胃1次/d，疗程5周。至第7周以10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后处死全部实验动物。

1.2.3 模型成功标准 造模结束后，参照《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010年修订版)》[1]中诊断标准，对大鼠血清ALT、AST、TG、TC以及肝组织病理变化判断造模成功与否。

2 结果

2.1 模型建立情况 在造模结束后，模型鼠较空白鼠血清ALT、AST、TG、TC明显升高，与模型组相比，各用药组大鼠血清ALT、AST、TG、TC有均有不同程度的降低，血清学指标提示造模成功。病理改变：空白组大鼠肝组织细胞形态正常，模型组肝腺泡2区及3区内见大小不均的脂肪空泡，肝细胞肿胀，且挤压肝窦，汇管区炎症较重。其他各用药组较模型组，在脂肪变性及炎症程度上均有不同程度减轻(图1)。镜下观察提示模型制备成功。

图1 6组大鼠肝脏病理改变(HE染色，×40) a:空白组；

2.2 各组大鼠肝匀浆FFA含量 模型组较空白组肝组织FFA升高明显(P<0.01)；各用药组肝组织FFA含量降低，其中高剂量组降低明显，较对照组差异有统计学意义(P<0.01)(表1)。

表1 各组大鼠肝匀浆FFA含量比较

注：1)与模型组比较，P<0.01；2)与对照组比较，P<0.01

2.3 各组大鼠肝ADPN、AdipoR2、AMPK、ACC、CPT-1mRNA表达情况比较 计算大鼠肝ADPN、AdipoR2、AMPK、ACC、CPT-1 mRNA相对表达采用2-ΔΔCt法。模型组ADPN、AdipoR2、AMPK、CPT-1 mRNA相对表达显著低于空白组及各用药组(P值均<0.01)，而ACC mRNA表达高于空白组及各用药组(P值均<0.01)。各用药组间，高剂量组对基因表达的改善明显优于对照组(P值均<0.01)(表2)。

2.4 各组大鼠肝匀浆ELISA检测ADPN、AdipoR2、AMPK、ACC、CPT-1含量 模型组与空白组相比较，ADPN、AdipoR2、AMPK、CPT-1的含量均显著降低，ACC含量明显升高(P值均<0.01)。高剂量组较对照组均能有效提高肝组织中ADPN、AdipoR2、AMPK、CPT-1的含量，降低ACC含量(P值均<0.01)(表3)。

3 讨论

中医没有NASH的病名，据其临床表现归属于“肝癖”、“肝着”等范畴。过食肥甘、多卧少动、情志失调等因素，致肝失疏泄、脾失健运，湿、痰、瘀交织互结，阻滞肝络，发为本病。在化痰祛湿活血基本治法原则下，选用泽泻、丹参为君药，化痰消瘀，利水祛湿；郁金、海藻、山楂为臣药，助君药化痰消瘀，行气活血；决明子与水飞蓟为佐药祛瘀血日久所化之热；柴胡为使药，疏肝理气，引药归经；全方共奏祛湿化痰活血之功。

NASH发病机制复杂，流行病学调查证实，低脂联素血症是NAFLD和肝功能障碍的独立危险因素，NASH患者血清ADPN含量比健康人群降低50%以上[10-12]。肝脏中AdipoR2表达降低可能是NASH的病理生理学因素之一，ADPN与AdipoR2结合后介导AMPK信号通路，可调控肝脏糖、脂质代谢，缓解NASH的发生[13-14]。其分子机制主要为以下2点[15]：(1)AMPK是一种细胞内能量代谢调节因子。它的活性是通过感应细胞胞浆的一磷酸腺苷与三磷酸腺苷比值，调节肝糖的输出。(2)活化的AMPK可通过磷酸化形式使ACC活性降低，CPT-1含量增加，丙二酰辅酶A减少，增强脂肪酸氧化分解，降低FFA水平，减轻肝内脂肪蓄积。

本实验结果显示，化痰祛湿活血方能够有效提高ADPN、AdipoR2、AMPK、CPT-1mRNA，降低ACC mRNA表达，同时调控肝组织中其蛋白表达量，减少组织中FFA含量。通过化痰祛湿活血方的干预，ADPN与表达于肝脏的AdipoR2结合后，激活AMPK，使下游限速酶ACC磷酸化活性降低，胆固醇的合成原料下降，减少肝细胞脂肪沉积；另一方面AMPK负性调节ACC活性，增加CPT-1表达，从而抑制脂肪酸的β氧化及合成，减少肝脏脂肪的含量。这一通路的变化可能是化痰祛湿活血方防治NASH的药理环节。该方是否对NASH发病机制中其他环节也具有调控作用，尚待进一步研究。

表2 各组大鼠ADPN、AdipoR2、AMPK、ACC、CPT-1 mRNA表达比较

注：1)与模型组比较，P<0.01；2)与对照组比较，P<0.01

表3 各组大鼠肝匀浆ADPN、AdipoR2、AMPK、ACC、CPT-1含量比较

注：1)与模型组比较，P<0.01；2)与对照组比较，P<0.01

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引证本文：ZHAO WX, YAN L, SHAO MY, et al. Effect of Huatan Qushi Huoxue prescription on the ADPN/AMPK/ACC signaling pathway in rats with nonalcoholic steatohepatitis[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(5): 932-936. (in Chinese) 赵文霞， 闫乐， 邵明义， 等. 化痰祛湿活血方对非酒精性脂肪性肝炎大鼠ADPN/AMPK/ACC通路的影响[J]. 临床肝胆病杂志, 2017, 33(5): 932-936.

(本文编辑：朱 晶)

Effect of Huatan Qushi Huoxue prescription on the ADPN/AMPK/ACC signaling pathway in rats with nonalcoholic steatohepatitis

ZHAOWenxia,YANLe,SHAOMingyi,etal.

(DepartmentofSplenic,Gastric,andHepatobiliaryDiseases,TheFirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450000,China)

Objective To investigate the effect of Huatan Qushi Huoxue prescription on the adiponectin (ADPN)/adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK)/acetyl-CoA carboxylase (ACC) signaling pathway in rats with nonalcoholic steatohepatitis (NASH). Methods A total of 72 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into blank group, model group, control group, and high-, middle-, and low-dose Huatan Qushi Huoxue prescription groups. All rats except those in the blank group were given high-fat diet combined with intraperitoneal injection of tetracycline to establish a rat model of NASH. At week 2 after model establishment, the Huatan Qushi Huoxue prescription groups were treated with high-, middle-, and low-dose Huatan Qushi Huoxue prescription, and polyene phosphatidylcholine (Yishanfu) capsules were given as control. At the end of the experiment, the content of free fatty acid (FFA) in liver homogenate was measured, and ELISA and RT-qPCR were used to measure the protein and mRNA expression of ADPN, adiponectin receptor-2 (AdipoR2), AMPK, ACC, and carnitine palmitoyltransferase-1 (CPT-1) in liver tissue. An analysis of variance was used for comparison of data between multiple groups; the least significant differencet-test was used for comparison of data with homogeneity of variance between two groups, and the Dunnett's T3 method was used for comparison of data with heterogeneity of variance. Results Compared with the control group, the high-dose group had significant reductions in FFA level in liver homogenate (229.07±46.62 μmol/gprot vs 382.75±30.93 μmol/gprot,P<0.01) and mRNA and protein expression of ACC in liver tissue (mRNA: 1.66±0.04 vs 2.40±0.37,P<0.01; protein: 512.20±60.70 pg/g vs 756.72±61.21 pg/g,P<0.01), as well as significant increases in the mRNA and protein expression of ADPN (mRNA: 1.53±0.31 vs 0.75±0.11,P<0.01; protein: 22.23±2.75 μg/g vs 14.01±2.17 μg/g,P<0.01), AdipoR2 (mRNA: 1.38±0.33 vs 0.61±0.09,P<0.01; protein: 128.41±10.46 ng/g vs 94.62±6.88 ng/g,P<0.01), AMPK (mRNA: 1.43±0.39 vs 0.78±0.04,P<0.01; protein: 1353.79±59.52 μg/g vs 1107.19±56.78 μg/g,P<0.01), and CPT-1 (mRNA: 1.39±0.31 vs 0.52±0.04,P<0.01; protein: 175.54±9.91 U/g vs 128.74±12.74 U/g,P<0.01). Conclusion Huatan Qushi Huoxue prescription can effectively activate the ADPN/AMPK/ACC signaling pathway, which may affect the β oxidation and synthesis of fatty acids and reduce fat deposition in hepatocytes.

nonalcoholic steatohepatitis; Huata Qushi Huoxue recipe; adiponectin； amp-activated protein kinase； acetyl-CoA carboxylase

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.05.029

2017-02-13；

2017-03-03。

河南省中医临床学科领军人才培育项目；国家自然基金(81473651)

赵文霞(1956-)，女，教授，博士生导师，主要从事中医药防治肝胆系疾病研究。

R575.5

A

1001-5256(2017)05-0932-05