成体肝祖细胞的研究进展

李 飞， 马振增， 陆伦根

(上海交通大学附属上海市第一人民医院 消化科， 上海 200080)

成体肝祖细胞的研究进展

李 飞， 马振增， 陆伦根

(上海交通大学附属上海市第一人民医院 消化科， 上海 200080)

肝脏具有极强的再生能力，在遭受急性损伤时，由成熟肝细胞增殖完成肝再生。但在肝脏遭受慢性损伤时，成熟肝细胞增殖能力受损或耗竭，肝祖细胞活化、增殖、分化，参与肝再生。介绍了肝祖细胞的特征及来源，在肝损伤后组织修复和肝癌发生中的作用，以及用于细胞移植治疗肝脏疾病的潜能和面临的问题。认为对于肝祖细胞的生物学特性及其在肝损伤和肝癌中的作用和发病机制的认识有利于肝病的治疗。

肝祖细胞； 肝再生； 癌， 肝细胞； 干细胞移植； 综述

肝祖细胞又称为小肝细胞、胆管上皮样细胞，是一类分布于成体肝脏，具有双向分化潜能的异质性细胞。研究表明，肝祖细胞在肝再生、肝癌的发生发展中发挥重要作用，并有望用于慢性肝病的治疗。本文回顾了近几年的文献，对肝祖细胞的特征、起源，及其在肝再生和肝癌以及细胞移植治疗中的作用作一综述。

1 肝祖细胞的特征和起源

肝祖细胞直径约为10 μm，细胞核呈卵圆形，核大，胞浆少，因此小鼠肝祖细胞又称为卵原细胞。肝祖细胞表达细胞角蛋白(cytokeratin CK)19、上皮细胞黏附分子、 卵圆细胞标志物6[1]、叉头框蛋白A2[2]、Sox9[3]，部分表达CD44、Alb和AFP[4]。有文献[5-7]报道，肝祖细胞表面也表达造血干细胞标志物Thy-1、Lgr5 和c-kit。由于肝祖细胞可能具有多种起源，及其分化状态的异质性，迄今为止，尚未找到一种相对特异的标志物来鉴定肝祖细胞。

关于肝祖细胞的起源，现存多种观点。多数学者认为，肝祖细胞主要来自赫氏小管区和终末胆管。Paku等[8]用2-乙酰氨基芴(2-acetyailamifluorene, 2-AAF)刺激大鼠制备肝损伤模型后腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine，BrdU)标记肝脏增殖细胞发现，24 h内赫氏小管区细胞即进入细胞周期(图1)；免疫组化分析发现增殖细胞表达CK和AFP，二者均为肝祖细胞标志物，表明肝祖细胞起源于赫氏小管区。Kuwahara等[9]用对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)制备小鼠肝损伤模型后，通过标记滞留细胞法发现在赫氏小管区出现CK和BrdU双阳性细胞，该细胞体积小，细胞核呈类圆形，核浆比大，能长期存在并增殖和分化为肝细胞；定量分析表明肝祖细胞及其分化而来的肝细胞占增殖细胞总数的90%以上。Huch等[6]发现Lgr5+肝祖细胞基因表达谱与胆管上皮细胞基因表达谱类似,该结果也表明肝祖细胞可能来源于终末胆管细胞。

图1 肝祖细胞起源 a：免疫电镜显示，2-AAF刺激大鼠2 d后肝脏赫氏小管区细胞开始增生。该赫氏小管由4个细胞构成，其中3个标记BrdU,进入有丝分裂期；图中★显示一BrdU细胞，紧邻赫氏小管细胞；b：2-AAF刺激合并部分肝切除后3 d，终末胆管(D)部分基底膜(红色，层黏连蛋白标记)连续性中断(箭头)，并出现胆管样细胞(绿色，角蛋白标记，▲)，与肝细胞(H)直接接触

但也有学者报道，肝祖细胞可起源于骨髓干细胞。有文献[10]报道6例器官移植患者，2例骨髓移植系男性向女性患者提供骨髓，4例肝移植则为女性向男性提供肝脏，结果显示所有受体肝组织均见Y染色体阳性(Y+)肝细胞，提示骨髓移植女患者Y+肝细胞源于男性供体，而肝移植男患者Y+肝细胞源于自身骨髓或血源性干细胞。Tsolaki等[11]报道骨髓干细胞能够发育成肝祖细胞。该研究团队将不同种系的雄性大鼠骨髓移植给经致死量放射线照射后的雌性受体鼠，再用肝毒性药物和部分肝切除术制备肝损伤模型，诱导肝祖细胞的活化和增殖；再以供体鼠骨髓细胞的特异标志物(Y染色体、双肽酶Ⅳ和L21-6抗原)为标记进行免疫组化染色，结果发现有部分肝祖细胞为供体骨髓细胞来源。

另有研究表明，肝祖细胞可由成熟肝细胞去分化而来。Braun等[12]将含有LacZ基因的成熟肝细胞移植给受体鼠3个月后给予肝毒性药物和部分肝切除，在不同时间点对肝组织进行组化分析发现：19%的肝祖细胞来源于供体肝细胞；35%的肝实质细胞来源于供体肝细胞。该实验表明肝祖细胞可以起源于成熟肝细胞的去分化。但是，Wang等[13]将Fah+/+肝细胞移植给Fah-/-小鼠使90%肝细胞呈Fah阳性，再经3～6周1,4-二氢-2,4,6-三甲基-3,5-吡啶二甲酸二乙酯饲料喂养，经检测发现超过97%的肝祖细胞呈Fah阴性，该实验表明肝祖细胞并非主要由成熟肝细胞去分化而来。由此可见，肝祖细胞具有多种起源，其中，赫氏小管区和终末胆管是其主要来源。而肝细胞和骨髓干细胞可能在特定病理条件下才去分化或转分化为肝祖细胞，或者作为肝祖细胞起源的储备。

2 肝祖细胞与肝再生

肝脏能通过两种再生方式进行组织结构和功能的修复。在大部肝切除手术后，成熟肝细胞首先表现为体积增大，然后在20～24 h内即进入细胞周期开始有丝分裂恢复肝脏的体积和功能，大鼠完成该过程仅需2周，人类需要2个月[14-15]。但在遭受严重或慢性肝损伤时，成熟肝细胞的增殖能力被抑制或者耗竭，肝祖细胞活化、增殖，由门静脉区向肝实质逐渐延伸，并分化为成熟的肝细胞和胆管细胞，实现对受损肝脏的修复。Sackett等[16]通过构建Foxl1-Cre；Rosa26 lacZ转基因小鼠示踪肝祖细胞在肝损伤后的增殖、分化过程，结果显示肝祖细胞可分化为成熟的肝细胞和胆管细胞。

肝祖细胞增殖反应与肝损伤严重程度呈正相关，影响其活化、增殖、分化的因素较多，现已发现肿瘤细胞因子样凋亡微弱诱导剂(TNF-like weak inducer of apoptosis ，TWEAK)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)7、IL-6、 TNFα等细胞因子或炎症因子能调节其生物学行为[15]。TWEAK及其受体Fn14对肝祖细胞增殖的调节作用备受关注。在正常肝组织中，Fn14主要表达于胆管细胞和平滑肌细胞，而在慢性丙型肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病和肝癌患者中，Fn14的表达升高，并主要表达在胆管细胞和胆管样结构。动物实验[17-19]表明，在小鼠肝脏过表达TWEAK后，受损肝组织中肝祖细胞增生反应更为明显，而通过封闭型抗体阻断TWEAK或在Fn14被敲除后，肝祖细胞增殖能力下降，表明TWEAK/Fn14通路能促进肝祖细胞介导的肝组织修复过程。Ishikawa等[20]通过构建肝组织特异HGF/c-Met(HGF/HGF受体)基因敲除鼠研究HGF/c-Met信号通路在肝祖细胞介导的肝再生中的作用。发现与对照组相比，HGF敲除鼠肝祖细胞的增殖能力下降了2/3，由其分化而来的肝细胞数量也显著下降；同时肝祖细胞由门静脉区向中央静脉区迁移的距离明显缩短；同时发现HGF敲除鼠肝祖细胞周围巨噬细胞减少，造成其微环境改变。由此可见，HGF能影响小鼠肝祖细胞增殖、分化和迁移能力，并改变其微环境。FGF在组织发育和器官形成中发挥重要作用，同时参与调节上皮组织和器官的损伤修复。研究[21]发现，肝脏基质细胞表达多种FGF亚型，并且肝祖细胞表达FGF受体2b(FGFR2b) 。据此推测，FGF可能参与调节肝祖细胞的生物学行为。Takase等[22]发现，FGF-7在急性肝衰竭患者血清中显著升高；在肝损伤小鼠肝祖细胞中也高表达，并与肝祖细胞的数量呈正相关。该研究团队还发现FGF-7基因敲除小鼠肝损伤后肝祖细胞增殖反应显著下降，模型小鼠的死亡率也明显升高；再通过转基因技术在FGF-7基因敲除小鼠肝组织恢复FGF-7的表达后，肝祖细胞数量增加，由肝祖细胞分化而来的肝细胞亦增加，血清生化指标获得明显改善，表明FGF-7在肝祖细胞介导的肝再生中发挥极其重要的作用。在肝祖细胞分化过程中，wnt/β-catenin和notch信号通路发挥相互平衡的作用。wnt/β-catenin促进肝细胞的分化；而notch信号通路促进胆管细胞的分化，并抑制肝细胞的分化[14]。

3 肝祖细胞与肝癌

肝祖细胞与肝癌的发生密切相关。研究表明28%～50%的肝细胞癌表达肝祖细胞标志物，如CK-19、AFP和CD133，因此有学者推测肝细胞癌可能起源于肝祖细胞。Roskams等[23]发现CK-19阳性的肝细胞癌患者瘤体更大，癌细胞侵袭性和转移能力显著增强，患者预后更差；免疫标记显示癌细胞表达肝祖细胞标志物。Lee等[24]通过基因表达聚类分析发现，部分肝细胞癌患者癌组织与大鼠胚胎肝母细胞具有类似的基因表达谱，这类患者在性别、年龄和AFP表达情况等方面相似；与具有肝细胞基因表达谱的肝细胞癌患者相比，这类患者中位生存期明显缩短，预后差，表明部分肝细胞癌可起源于肝祖细胞。Tang等[25]发现在再生肝脏中，每3×104～5×104个细胞中含有2～4个细胞表达干细胞标志物Stat3、Pgf5 和Nanog，同时表达分化前蛋白TGFβ受体Ⅱ和胚肝胞衬蛋白,但表达干细胞标志物的癌细胞却低表达TGFβ受体Ⅱ和胚肝胞衬蛋白， TGFβ信号通路下调，IL-6/Stat3信号通路上调，提示肝细胞癌可能起源于IL-6/Stat3信号通路上调同时TGFβ信号通路下调的肝干/祖细胞。而在胎肝祖细胞中过表达β-catenin 信号分子26周后，92%的小鼠自发形成肝恶性肿瘤(肝细胞癌或肝母细胞瘤)，其中肝细胞癌组织高表达β-catenin和成体肝祖细胞标志物AFP、Sox4、Sox9等原始细胞标志物[26]。上述实验均提示肝细胞癌可以由肝祖细胞转化所致，但其发病机制仍有待进一步探索。临床病理研究表明，胆管细胞型肝癌亦可起源于肝祖细胞。Komuta等[27]对30例胆管细胞型肝癌患者的癌组织和癌旁肝祖细胞分析表明，部分胆管细胞型肝癌患者癌组织表达肝祖细胞标志物，基因表达谱也类似，其中19例患者癌组织中有导管样腺体形成，这些特征都表明部分胆管细胞型肝癌可能起源于肝祖细胞。

4 肝祖细胞与细胞移植治疗

目前肝移植是终末期肝病患者唯一有效的治疗手段，但由于供体肝的缺乏，绝大多数患者无法获得肝移植治疗。肝祖细胞可以从患者自身获得并在体外进行大量扩增，且能避免异体移植所带来的免疫排斥，因此采用肝祖细胞进行移植有望成为肝移植外的另一治疗方案[28]。Najimi等[29]将人肝祖细胞通过脾静脉移植给重症联合免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)10周后，在受体小鼠肝脏出现人肝细胞结节，免疫组化显示该细胞表达Alb、前白蛋白和AFP。该实验表明肝祖细胞在移植到受体小鼠肝脏后能增殖并分化为肝细胞，具备潜在的细胞移植治疗肝脏疾病的可能。而Maerckx等[30]将人肝祖细胞移植给Gunn小鼠(该小鼠肝细胞缺乏葡萄糖醛酸转移酶，致胆红素结合障碍，引起血清中非结合胆红素升高和黄疸)，受体小鼠胆红素代谢障碍能获得一定程度好转，表明肝祖细胞移植能改善肝脏的功能，进一步表明肝祖细胞移植能用于肝病治疗。虽然如此，肝祖细胞移植治疗进入临床应用其安全性和可行性仍存在诸多问题：(1)安全性。肝祖细胞移植入体内后是否会定位到肝脏以外的器官而出现不可预知的副作用；另外，肝祖细胞是否会在受者体内形成肿瘤也有待进一步实验证实[15]；(2)标准化。肝祖细胞的异质性、肝脏疾病的多样性、患者个体差异性使得肝祖细胞移植治疗更为复杂，因此需要制订相应的标准对其适应证和技术方案进行规范[31]。

5 小结

综上， 肝祖细胞参与肝脏多种病理过程，对其活化、增殖和分化的机制研究及其影响因素的探索具有重要的理论意义。随着研究的深入，肝祖细胞被发现在慢性肝损伤和原发性肝癌中发挥重要作用，其相关机制也被部分阐明，这对肝脏疾病的防治具有重要意义，有利于开发诱导肝祖细胞向肝细胞和胆管细胞分化以及预防或抑制原发性肝癌的药物。

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引证本文：LI F, MA ZZ, LU LG. Research advances in adult hepatic progenitor cells[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(5): 994-997. (in Chinese) 李飞， 马振增， 陆伦根. 成体肝祖细胞的研究进展[J]. 临床肝胆病杂志, 2017, 33(5): 994-997.

(本文编辑：朱 晶)

Research advances in adult hepatic progenitor cells

LIFei,MAZhenzeng,LULungen.

(DepartmentofGastroenterology,ShanghaiFirstPeople'sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200080,China)

The liver has a strong regenerative capacity, and in case of acute injury, the proliferation of mature hepatocytes helps to complete liver regeneration. However, in case of chronic injury, the proliferative capacity of mature hepatocytes is damaged or exhausted, and the activation, proliferation, and differentiation of hepatic progenitor cells are involved in liver regeneration. This article summarizes the characteristics and origins of hepatic progenitor cells, their role in tissue repair after liver injury and development of liver cancer, and potentials and problems of cell transplantation in the treatment of liver diseases. It is pointed out that an understanding of the biological characteristics of hepatic progenitor cells, their role in liver injury and liver cancer, and related pathogenesis helps with the treatment of liver diseases.

hepatic progenitor cells; liver regeneration; carcinoma, hepatocellular； stem cell transplantation; review

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.05.043

2016-10-14；

2017-01-08。

国家自然科学基金资助项目(81470858)；2015年上海市领军人才计划(056)

李飞(1985-)，男，博士，主要从事肝祖细胞在肝再生中的作用及其机制研究。

陆伦根，电子信箱: lungenlu1965@163.com。

R735.7

A

1001-5256(2017)05-0994-04