草甘膦对胰蛋白酶、胃蛋白酶及禽类DNA的影响*

杨利艳 虞 波 杨 楠 张翔宇 高妙妙 陕嘉楠 张慧洁

（1山西师范大学现代文理学院 山西临汾 041004 2山西师范大学生命科学学院 山西临汾 041004）

草甘膦，即 N-（膦羧甲基）甘氨酸（C3H8NO5P）,通过抑制EPSP合成酶破坏莽草酸途径，由此造成EPSP缺乏导致芳香族氨基酸减少，同时草甘膦也能通过抑制光合作用中ATP合成酶而抑制光合磷酸化的过程，从而达到除草效果［1］。研究发现，草甘膦在植物和动物饲料中都有残留，大豆中草甘膦的残留量达到17 mg/kg。喷洒过草甘膦的农田，在后茬作物例如草莓、生菜、胡萝卜、大麦等作物中仍发现有草甘膦残留［4］。草甘膦作为广谱除草剂目前已成为世界上应用最广、使用量最大的农药品种，对农业高产丰收起到重要作用。草甘膦的主要应用及全球需求量如表1所示［2-3］。近年来，除草剂残留的安全性受到公众越来越多的关注。有人认为残留的草甘膦可能会通过食物链进入人体从而引起异常的生理效应［5］。有研究表明，高浓度的草甘膦会轻微抑制人体的免疫功能［6］；草甘膦对皮肤有轻度刺激作用，急性中毒时可出现恶心、呕吐、头昏、腹痛、呼吸困难、共济失调，甚至造成低血压或肺水肿［7］。草甘膦进入消化道后对重要的消化酶有无影响，经消化后进入血液会产生何种效应等问题亟待了解，本研究试图探究不同浓度草甘膦对生物大分子如胰蛋白酶、胃蛋白酶、DNA构象的影响，并通过模拟体内消化环境，了解草甘膦残留对血液的影响。

表1 草甘膦的用量及应用（2006—2010年）

1 材料与方法

1.1 材料 除草剂草甘膦（孟山都农达41%草甘膦灭生性除草剂）按照说明，分别配制标准使用浓度（T1）、1.5 倍（T2）、2 倍（T3）、3 倍（T4）浓度的草甘膦溶液进行玉米叶片喷施，以喷施等量蒸馏水为对照（CK）。

玉米（Zea mays）种子郑58由山西省农科院小麦研究所玉米课题组提供。温室种植，常规管理，待长至三叶期，取材。

胃蛋白酶、胰蛋白酶购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 鸡血DNA的提取 取新鲜鸡血细胞液（5～10 mL），利用 DNA在 0.14 mol/L的氯化钠溶液中溶解度最低，蛋白质溶解度高的特点，提取DNA并纯化。

1.2.2 胃蛋白酶、胰蛋白酶、DNA构象的变化测定 计算并称量胃蛋白酶粉末，加蒸馏水溶解，水浴至37℃，分装，分别加入1/1 000体积的T1、T2、T3、T4草甘膦溶液，以加入等量蒸馏水为对照。采用TU-1901双光束紫外分光光度计（北京普析公司）分别测定各组胃蛋白酶吸光值。胰蛋白酶吸收峰及吸光度的变化测定同胃蛋白酶。

将不同浓度的草甘膦滴入DNA溶液中，采用TU-1901双光束紫外分光光度计测定DNA的吸光度。

1.2.3 人体胃液、肠液的模拟 分别加入1 g Na-Cl，1.6 g胃蛋白酶，3.5 mL 36.5%浓盐酸，然后定容至 500 mL，调节 pH到 1.3，配制成模拟胃液。将1.36 g磷酸氢二钾溶于约100 mL蒸馏水中，另取2 g胰蛋白酶加水溶解，定容至200 mL，氢氧化钠调节pH至7.6，制成模拟肠液。将模拟唾液环境中的喷施过不同浓度草甘膦的玉米叶分别转移到胃液5 h后再转移到模拟肠液中。

1.2.4 血相指标的测定 离心肠液消化后的产物，弃上清液，加入已加抗凝剂的等量鸡血中振荡培养2 min，取血样送于山西省临汾市尧都区明林动物医院进行血相指标检测。

2 结果与分析

2.1 草甘膦对胰蛋白酶、胃蛋白酶、禽类DNA的影响

2.1.1 不同浓度草甘膦对胃蛋白酶构象的影响蒸馏水加入胃蛋白酶溶液后，将其反应液于波长为280 nm处进行扫描，结果显示胃蛋白酶在276 nm处有最大吸收峰，吸光度为1.105 Abs。

图1 不同浓度草甘膦下胃蛋白酶的光谱扫描图

不同浓度的草甘膦溶液加入胃蛋白酶溶液后，其最大吸收峰和吸光度均发生了变化，总趋势为：随着草甘膦浓度的增加，胃蛋白酶溶液的吸光度增大；T1组草甘膦较蒸馏水使胃蛋白酶溶液最大吸收峰左移，草甘膦浓度增加，其最大吸收峰不再改变。

表2 不同浓度草甘膦下胃蛋白酶的最大波峰及其吸光度

表2中的数据与图1扫描结果相吻合。可见，草甘膦处理后，其反应液吸光度较对照组增大，表明一定浓度的草甘膦对胃蛋白酶有一定影响，且在等量的人工胃液中加入0.01 g草甘膦时影响最大。结果说明，草甘膦与胃蛋白酶的相互作用会改变芳香族氨基酸残基在空间结构中所处的微环境，使其所处环境的疏水性增强。同时表明，取食有草甘膦残留达0.01 g的作物后可能对动物胃蛋白酶的构象影响最大。

2.1.2 不同浓度草甘膦对胰蛋白酶构象的影响结果可见，4个浓度的草甘膦均使胰蛋白酶最大吸收峰左移至268 nm，各处理均较对照吸光度升高，且随着草甘膦浓度升高，胰蛋白酶吸光度增加。

表3数据与图2结果一致，即随着草甘膦浓度的增加，胰蛋白酶的最大吸收峰均向左移，且均在268 nm处有最大吸收峰，同时吸光度也逐渐增加且均高于对照组。结果表明：草甘膦与胰蛋白酶的相互作用改变了芳香族氨基酸残基在空间结构中所处的微环境，使其所处环境的疏水性增强。说明动物取食有草甘膦残留的作物后对动物的胰蛋白酶的构象有一定影响，且随着草甘膦浓度的增加影响愈大。

表3 不同浓度草甘膦下胰蛋白酶的最大波峰及其吸光度

图2 不同浓度草甘膦下胰蛋白酶的光谱扫描图

2.1.3 不同浓度草甘膦对DNA构象的影响 由图3可知，对照组和处理组均在同一波长下有最大吸收峰。表4数据表明，各处理组中DNA均在260 nm处有最大吸收值，随着草甘膦浓度的增加，DNA的吸光度值在不断增加，且均高于对照。由此可知，一定浓度的草甘膦对DNA的构象有影响，且草甘膦的浓度越大影响越大。

图3 不同浓度草甘膦下DNA在190～600 nm波段处的综合光谱扫描图

表4 不同浓度草甘膦下DNA在最大波峰处的吸光度值

2.2 草甘膦残留对鸡血相指标的影响 由检测结果（表5）可以看出草甘膦残留对于鸡血相的各项指标均有不规律的影响，其中白细胞数量随草甘膦浓度增加呈先增后降的趋势，这是动物自身的免疫反应，同时也表明当草甘膦浓度达2倍标准使用浓度时，动物自身已无法调节。

表5 玉米叶片草甘膦残留对鸡血相指标的影响

3 结论与讨论

在动物体内，消化功能依靠胃肠运动的机械性消化和消化酶作用的化学性消化完成。消化液中含有大量消化酶，可促进食物中糖、脂肪、蛋白质的水解，由大分子物质变为小分子物质，以便被机体吸收利用。消化酶的生物活性受到影响时会对营养物质的消化和吸收造成不利，使机体产生一些病症［8］。胃液中的胃蛋白酶和胰液中的胰蛋白酶是2种重要的消化酶。本实验结果显示，不同剂量的草甘膦作用于胃蛋白酶和胰蛋白酶后会对其产生一定影响：随着草甘膦剂量的增加，胃蛋白酶和胰蛋白酶的最大吸收峰均向左移，且与对照组相比其吸光度值都明显增大，本实验结果说明使用标准浓度1.5倍以上剂量的草甘膦，与胃蛋白酶和胰蛋白酶的相互作用，会改变芳香族氨基酸残基在空间结构中所处的微环境，使其所处环境的疏水性增强，胃蛋白酶和胰蛋白酶构象受到影响，可能会对动物的消化产生影响。血相指标的变化表明，草甘膦残留经消化吸收进入血液中将会对禽类血液大部分指标（WBC、MCHC、PLT等）产生无规律且较大的影响。生物有机体内的主要遗传物质是DNA，本实验研究结果可知，不同剂量的草甘膦作用于DNA后其吸光度值均较对照组相比增大，且草甘膦的量越大，作用DNA后，DNA的吸光度值越大。核酸变性时，吸光度升高［9］，因此说明草甘膦与DNA相互作用后改变了DNA的构象破坏了其三级结构，使得游离的核苷酸浓度增加。

草甘膦目前注册登记作物已达50种以上［5］。研究表明，草甘膦可以在植物中进行代谢［6］，同时对动物有影响。妊娠期雌鼠长期接触草甘膦除草剂，会引起后代大脑的多种功能性变异［10］；草甘膦对怀孕雌鼠有毒害作用，并延迟其胎儿的骨骼发育［11］。在一定条件下草甘膦等除草药剂均会导致植物细胞产生大量的活性氧［12］，进而对细胞造成损伤［13］。 赵伟等［14］研究表明，草甘膦能降低小鼠的总抗氧化能力，引起机体脂质过氧化，损害蛋白质，使机体处于应激状态，增强致病因素的毒性作用，导致各种疾病的发生。有实验证明草甘膦对哺乳动物细胞具有致突变性，对小鼠精子产生损害，对雄性生殖细胞具有潜在的诱变危害［15］。肖永红等［16］研究表明，亚致死剂量的草甘膦溶液对中华大蟾蜍蝌蚪的生长发育具有明显的抑制作用，蝌蚪体长、体宽、尾长、尾宽和体质量的增长率均与草甘膦浓度呈负相关［17］。本实验发现随着草甘膦浓度的增加，其对鸡血DNA三级结构的影响愈大，即草甘膦浓度越高，动物精细胞吸收草甘膦后对生殖的潜在影响越大。草甘膦经消化吸收进入血液后会造成何种影响，也是本研究关注的问题。血相指标对血液吸收的物质非常敏感，本实验发现，经模拟胃液、肠液消化后的残留物对血相指标均有一定影响。因此，综合本实验研究结果，建议采用不同策略，例如：1）采用综合防治技术，例如农艺措施、机械除草、化学除草相结合；2）交替使用不同除草剂；3）开发新型除草剂；4）培育不同抗除草剂作物品种，以延缓或降低作物对草甘膦的抗性，从而降低草甘膦的使用，对保证动物的安全有重要意义。

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