茅台地区酱香型酒糟中高温放线菌的分离鉴定

白成松,陈 莉，*,卢红梅,周 莲,任勰柯

(1.贵州大学食品与酿酒工程学院,贵州贵阳 550003; 2.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州贵阳 550003)

茅台地区酱香型酒糟中高温放线菌的分离鉴定

白成松1,陈 莉1，*,卢红梅2,周 莲2,任勰柯2

(1.贵州大学食品与酿酒工程学院,贵州贵阳 550003; 2.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州贵阳 550003)

从茅台地区酱香型酒糟中筛选出耐高温菌株,编号为DF。对其进行个体形态观察、菌落形态观察、16S rDNA基因序列分析以及其对淀粉、纤维素、蛋白质等的降解能力的研究,结果表明,菌株DF菌落干燥紧实、基内暗黄色、表面白色粉状、不透明,生长温度范围为35～60 ℃,最适生长温度为55 ℃,通过16S rDNA基因序列分析以及系统发育树分析,可以初步鉴定菌株DF为产色高温单孢菌(Thermomonosporachromogena)。该菌株对淀粉、纤维素、蛋白质有一定的降解能力,可以用作降解酒糟的菌剂。

酱香型酒糟,高温放线菌,分离鉴定,16S rDNA

随着社会不断发展,人民生活水平的提高,白酒产量也不断增加,其生产过程中的副产物-酒糟量也随之增加,仅2015年贵州省的白酒酒糟量就达到100多万吨[1]。白酒鲜酒糟含水量大,加之又具有丰富的营养成分,含有淀粉、脂肪、蛋白质等,使其不耐贮存,如果不处理直接丢弃在环境中,就会造成酒糟资源的巨大浪费,还会对环境造成严重污染。因此,对白酒酒糟的处理已经成为一个亟待解决的问题。我国对酒糟研究起步较晚,近年来随着人们对酒糟资源的逐渐重视,在酒糟的综合利用方面开始加大资金投入和科研力度,取得了较大的进展,主要的应用包括生产饲料、有机肥、食用菌、食醋、制曲、高附加值生化产品、沼气等,有效利用好白酒酒糟不仅能降低丢糟造成的环境污染,还能大幅提高白酒副产物的附加值,但这些应用对酒糟的综合利用能力仍显不足。其中,有效利用酒糟生产有机肥是解决大量酒糟利用问题的重要方案。

高温菌是一类能在45 ℃以上生长和繁殖的微生物,具有耐热嗜热,降解性能好,代谢效率高等特点,在很多领域都发挥着重要的作用[2-4]。利用高温菌产生耐热酶，其特性能很好地加快酒糟成分的降解,明显缩短堆肥周期,把酒糟堆肥发酵为有机肥,这样,不仅能有效解决农作物肥料供应问题,还能解决酒糟资源化利用的问题[5-8]。目前,国内外暂没有关于白酒酒糟中高温放线菌的研究和应用,但有关于白酒酒糟中高温细菌的研究,用于研究酒糟复合菌剂,主要针对于贵州省[9]。因此,可以参考酒糟中高温细菌的研究方法,从酒糟中筛选大量降解性能好的优良高温菌株,并深入了解其特性,以便能够更好地利用高温菌资源,拓展其应用领域。

本研究从茅台地区酱香型白酒酒糟中分离筛选出耐高温菌株,通过对其进行分离鉴定和特性研究,以期为后续高温菌剂和白酒酒糟生物有机肥的制备奠定基础,这对于提高我省大量的酒糟资源的综合利用,拓宽高温菌的应用范围,促进我国白酒产业的更好发展以及环境保护都将具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酱香型白酒酒糟 取自贵州省仁怀市茅台镇第七轮次抛糟的酱香型白酒酒糟(取样时间:2013年5月,酒糟淀粉含量:15.3%;蛋白质含量:8.5%;脂肪含量:3.0%;水分含量:61.5%);碘化钾、碘(分析纯) Guizhou Sciencelab science &Technology Co.,Ltd.;无水乙醇、体积分数为95%乙醇(分析纯) 天津市富宇精细化工有限公司;可溶性淀粉(分析纯) 天津市永大化学试剂有限公司;高蛋白脱脂高钙奶粉(调制乳粉) 内蒙古伊利实业集团股份有限公司;羧甲基纤维素钠(分析纯) 天津市光复精细化工研究所;氯化钠(分析纯) 成都临江化工厂;刚果红 天津市科密欧化学试剂有限公司;高氏一号培养基、LB液体培养基 按文献[10]进行配制。

BCD-290W冰箱 青岛海尔股份有限公司;DMS-653广西生物数码显微镜 深圳市博宇仪器有限公司;∑IGMAZEISS电子扫描显微镜 北京普瑞赛司仪器有限公司;SPX-250B智能型生化培养箱 上海琅玕实验设备有限公司;YXQ-L S-5 D S 11立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;DHG-9140B(101-2B)智能型电热恒温鼓风干燥箱 上海琅玕实验设备有限公司;SN-CJ-IF洁净工作台 上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 酒糟中高温放线菌的分离筛选 在洁净工作台中,将酱香型白酒酒糟制成不同稀释梯度的菌液,再将稀释菌液均匀涂布在高氏一号培养基上,然后倒置于恒温恒湿培养箱中55 ℃培养24 h。仔细观察菌落特征和个体形态,将不同特征的生长良好的单个菌落用无菌接种针挑出,在高氏一号培养基上划线培养。经过多次重复过程(7～8次),得到了纯种的高温菌。

1.2.2 微生物形态特征 菌落形态:挑选分离纯化的菌株,用平板划线的方法接种在高氏一号培养基上,55 ℃培养12～24 h,观察菌落的的大小、形态、颜色、边缘等特征。个体形态:放线菌采用印片法,然后在光学显微镜下观察菌株形态。

1.2.3 最适生长温度 将在冰箱中保存的菌株在高氏液体培养基中活化1 d,取活化液涂布在高氏培养基平板上,置于35、40、45、50、55、60 ℃的恒温生化培养箱中培养,每个温度条件下培养3组,待菌落长到一定大小后,用十字交叉法测定菌落直径大小,取平均值,并绘制菌株的最适生长温度测量曲线图。

1.2.4 生长曲线 菌株的活化采用装有100 mL液体高氏一号培养基的250 mL三角瓶,50 ℃,120 r/min条件下摇床培养1 d。吸取1 mL摇匀的菌液,接种到装有100 mL高氏一号液体培养基的250 mL三角瓶中培养,每种菌株做3组,置于50 ℃,120 r/min条件下摇床培养,每隔1 d将三角瓶取出置于冰箱中保存,共测5 d,待全部培养结束后,依次将培养液用真空泵抽滤于定量滤纸上,再用蒸馏水清洗浸泡,再用真空泵抽滤于定量滤纸上,重复三次。最后在100 ℃条件下烘箱烘至恒重后,电子天平称量与之前定量滤纸的重量差,即为菌体干重,求出每组菌体干重平均值,并绘制菌株的生长曲线图。

1.2.5 微生物基因组DNA的提取 利用TIANamp Bacteria DNA Kit(天跟生化科技有限公司)提取实验菌株的DNA,其具体步骤参见试剂盒的说明书。DNA提取产物保存于-20 ℃冰箱中。

1.2.6 16S rDNA基因PCR扩增和测序 以提取的基因组DNA为模板,利用通用引物正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCTAG-3′)和反引物14928(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。所有PCR均在5 μL标准反应体系中进行。反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,52 ℃复性1 min,72 ℃延伸1 min,30个循环;最后于72 ℃延伸10 min。采用1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测,采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)回收PCR产物。纯化后的目的基因送上海生工公司进行测序。测序结果用Chromas软件参照正反序列图谱进行人工校正。

1.2.7 系统发育树的构建 用基本局部比对搜索工具(basic local alignment cearchtool,BLAST)将测序结果在美国国家生物技术信息中心(national center of biotechnology information,NCBI)中与己知细菌的16S rDNA基因序列进行同源性分析,并用MEGAS.10软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树,具体确定菌株的种属。

1.2.8 菌株的淀粉降解特性实验 将淀粉降解培养基融化,倒入平板,凝固后将平板倒置于30 ℃培养箱中过夜。在平板培养基上点种,分别在50 ℃和55 ℃的条件下培养3 d,每个温度条件设置3个平板,待培养时间结束后,在平板上滴加卢戈氏碘液,观察记录透明圈大小,并计算Hc值(透明圈的直径和其菌落直径的比值),根据Hc值的大小可以判断微生物分解淀粉能力的强弱[9]。

1.2.9 菌株的纤维素降解特性实验 配制纤维素降解培养基,倒入平板,凝固后将平板倒置于30 ℃培养箱中过夜。在平板培养基上点种,分别在50 ℃和55 ℃的条件下培养3 d。培养3 d后,在平板中倒入没过培养基的1 g/L的刚果红溶液,浸泡30 min,再用1 mol/L的NaCl溶液浸泡30 min,观察记录透明圈大小,并计算Hc值(透明圈的直径和其菌落直径的比值),根据Hc值的大小可以判断微生物分解纤维素能力的强弱[10]。

1.2.10 菌株的蛋白质降解特性实验 配制蛋白质降解培养基,倒入平板,凝固后将平板倒置于30 ℃培养箱中过夜。在平板培养基上穿刺接种,分别在50 ℃和55 ℃的条件下培养3 d。培养3 d后,观察记录透明圈大小(乳黄色褪去的面积大小[10]),并计算Hc值,根据Hc值的大小可以判断微生物分解蛋白质能力的强弱。

1.2.11 数据处理 实验中每个处理重复三次,数据应用origin软件作图。

2 结果与分析

2.1 菌株的形态特征

通过高温菌分离纯化实验得到一株高温菌,编号为DF,其菌落形态和菌株镜检图片分别见图1、图2。

图1 菌株DF的菌落形态Fig.1 Colonial morphology of strain DF

图2 菌株DF的镜检Fig.2 Microscopic examination of strain DF

由图1可以看出,菌株DF菌落表面干燥紧实、基内暗黄色,表面白色粉状、不透明、难挑取,菌落直径约为7 mm。由图2可以看出,菌丝体纤细,直径0.3～0.4 μm,无横隔膜、不断裂,可能为放线菌。

2.2 最适生长温度

从图3可以看出,菌株DF在55 ℃下生长的菌落最大,因此它的最适生长温度为55 ℃。菌株DF在35～60 ℃均能生长,其菌落大小呈先增长后下降趋势。在35～55 ℃内,菌株DF菌落大小值呈不断上升,在55 ℃时达到最大值,随后菌落大小逐步下降,到60 ℃时,菌株不再生长。

图3 菌株DF的最适生长温度Fig.3 The optimum growth temperature curve of strain DF

2.3 菌株的生长曲线

从图4中可以看出,菌体干重随着培养时间呈现先上升后下降趋势,在培养的第1～3 d之间,菌体干重呈直线增加,到第3 d达到最大值,第3 d以后开始下降。从菌体DF干重的变化趋势来看,菌株DF发酵周期在第3 d。

图4 菌株DF的生长曲线Fig.4 Growth curve of strains DF

2.4 16S rDNA基因系统发育分析

用1%琼脂糖凝胶电泳检测16S rDNA基因扩增产物,发现在1000～2000 bp正中间处有一明亮条带,测序结果为1522 bp,与检测结果相符合,电泳图如图5所示。将菌株DF的16S rDNA基因序列测序结果与NCBI中已报道的模式菌株序列进行比对,结果表明,菌株DF与Thermomonosporachromogena的置信度到达99%。用MEGA5.10构建的系统发育树如图6所示,通过与进化关系比较亲近的属种进行系统发育学分析,菌株DF属于高温单孢菌属(Thermomonospora),与高温单孢菌属中的

图5 菌株DF的16S rDNA PCR扩增电泳图Fig.5 16S rDNA PCR amplification electrophoretoaram of strains DF注:M为Marker,DF、DF是同一菌株。

图6 菌株DF基于16S rDNA建立的系统发育树Fig.6 The of phylogenetic tree of strain DF based on 16S rDNA sequence

Thermomonosporachromogena亲缘关系最近,两者在同一进化分支上。结合菌株DF的细胞形态、菌落形态、生理生化特征、16S rDNA基因序列分析以及系统发育分析可以初步鉴定菌株DF是产色高温单孢菌(Thermomonosporachromogena)。

2.5 菌株的降解特性实验

从表1可以看出,菌株DF对淀粉、纤维素和蛋白质都有一定降解能力,在不同温度下,菌株DF对淀粉、纤维素和蛋白质降解能力也各不同。菌株DF在55 ℃条件下对淀粉、纤维素和蛋白质的降解能力比在50 ℃条件下对淀粉、纤维素和蛋白质的降解能力要强,其中的机理还需进一步研究,但可以通过控制培养温度来调节菌株DF对淀粉、纤维素和蛋白质的降解能力。

表1 菌株DF降解淀粉、纤维素、蛋白质的实验结果Table 1 Experimental results of degrading of starch,cellulose and protein

3 结论

从茅台地区酱香型酒糟中分离筛选出一株耐高温菌株,编号为DF。通过对菌株DF的细胞形态、菌落形态、生理生化特征、16S rDNA基因序列分析以及系统发育分析可以鉴定菌株DF为产色高温单孢菌(Thermomonosporachromogena)。其生长温度范围为35～60 ℃,最适生长温度为55 ℃。由菌株DF进行降解实验可知,菌株DF能够一定程度上降解淀粉、纤维素和蛋白质,在不同的温度条件下,对淀粉、纤维素和蛋白质降解能力也各不同,55 ℃条件下对淀

粉、纤维素和蛋白质的降解能力比在50 ℃条件下对淀粉、纤维素和蛋白质的降解能力要强。菌株DF从白酒酒糟分离得到,又具有降解淀粉、纤维素和蛋白质的特性,所以可以将其应用到降解白酒酒糟中淀粉、蛋白质,纤维素上来,一方面解决了我省大量酒糟贮存问题和对其处理的问题,治理了环境;另一方面又变废为宝,将酒糟变成可再次利用的资源,节约了资源。

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Isolation and identification of thermoactinomycete from Moutai-flavor vinasse in Moutai region

BAI Cheng-song1,CHEN Li1，*,LU Hong-mei2,ZHOU Lian2,REN Xie-ke2

(1.College of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550003,China;2.Guizbou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy,Guizhou University,Guiyang 550003,China)

High temperature resistant strains were isolated from Moutai-flavor vinasse,numbered as DF. The individual morphology and colony morphology were observed,and the 16S rDNA gene was sequenced,and starch,cellulose and protein degradation ability of high temperature resistant strains were studied. The results showed that colony of the strain DF was dry and tight,and the inside of the medium was dark yellow,and the surface had a white and opaque powder. The growth temperature ranged from 35 to 60 ℃. The optimum growth temperature was 55 ℃. The strain DF was identified preliminarily asThermomonosporachromogenaby 16S rDNA gene sequences analysis and phylogenetic tree analysis. The strain had some degradation ability of starch,cellulose and protein. It could be used as bacteria agent of lees degradation.

Moutai-flavor vinasse;thermoactinomycetes;isolation and identification;16S rDNA

2016-09-01

白成松(1991-)，男，硕士研究生，研究方向：发酵工程，E-mail:980235395@qq.com。

*通讯作者:陈莉(1981-)，女，硕士，副教授，研究方向：微生物，E-mail:chen_ccll@126.com。

贵州省科技合作计划项目(黔科合LH字[2016]7453号)；贵州大学研究生创新基金(2016055)。

TS262.3

A

1002-0306(2017)08-0199-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.030