分散液液微萃取-高效液相色谱联用测定水样中的氟喹诺酮类药物

王振忠,汤尚文,樊 靓,*

(1.湖北医药学院药学院,湖北十堰 420000; 2.湖北省药用植物综合利用工程技术研究中心,湖北十堰 420000; 3.武当特色中药研究湖北省重点实验室,湖北十堰 420000; 4.湖北文理学院化学与食品科学学院,湖北襄阳 441053)

分散液液微萃取-高效液相色谱联用测定水样中的氟喹诺酮类药物

王振忠1,2,3,汤尚文4,樊 靓1,2,3,*

(1.湖北医药学院药学院,湖北十堰 420000; 2.湖北省药用植物综合利用工程技术研究中心,湖北十堰 420000; 3.武当特色中药研究湖北省重点实验室,湖北十堰 420000; 4.湖北文理学院化学与食品科学学院,湖北襄阳 441053)

建立了一种分散液液微萃取-高效液相色谱联用测定水样中6种氟喹诺酮类药物的方法,采用萃取剂萃取后经氮气吹干再用微量流动相复溶的进样方式,考察了影响萃取效率的因素,包括萃取剂和分散剂的种类、用量、样品pH。结果表明,以500 μL三氯甲烷为萃取剂,800 μL乙腈为分散剂,调节萃取体系pH为7时,6种氟喹诺酮药物的富集倍数最高可达245倍,检出限为0.075～0.34 μg/L。在汉江水、鱼塘水、自来水中的加标回收率为88.6%～109.3%,相对标准偏差不高于5.8%。该方法基质效应小,富集倍数高,并且改善了传统DLLME萃取后的萃取剂直接进样色谱峰变形的缺点。应用于水样中残留氟喹诺酮类药物的检测,灵敏度高、简便、准确。

氟喹诺酮类药物,高效液相色谱,分散液液微萃取,水样

氟喹诺酮类药物(Fluoroquinolones,FQs)是一类人工合成的重要广谱抗菌剂,被广泛用于治疗人类及动物的多种感染性疾病[1]。人类和动物摄入的FQs药物通常都会经尿液排泄及农作物施肥进入环境水域[2]。由于FQs具有很强的耐微生物降解能力,长期饮用含FQs的水会使人的致病菌产生耐药性,对疾病的疗效降低甚至失效[3-4],故环境水域中的FQs对生态系统及人类饮水安全有潜在危害。为了研究水样中的FQs对人类健康和环境生态的影响,有必要建立一种水样中FQs的测定方法。

水样中的FQs多处于痕量水平,基质复杂,需要分离富集后再测定[5]。分散液液微萃取(Dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)是2006年由Assadi[6]等提出的一种新型少溶剂的样品前处理技术,是一种极具应用潜力的样品前处理方法,广泛应用于环境分析中[7-9]。但是该方法萃取后若直接进样,由于选用的萃取剂和流动相的相容性有限,容易导致色谱峰变形,检测灵敏度降低。

本实验应用DLLME技术,使用密度比水大的三氯甲烷为萃取剂,在萃取后将萃取剂全部抽出,经N2吹干后用微量流动相复溶浓缩,和高效液相色谱联用,测定了实际水样中的6种FQs。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

六种氟喹诺酮类药物：司帕沙星(Sparfloxacin,Spa)、氧氟沙星(Ofloxacin,Ofl)、依诺沙星(Enoxacin,Eno)、洛美沙星(Lomfloxacin,Lom)、加替沙星(Gatifloxacin,Gat)、环丙沙星(Ciprofloxacin,Cip) 美国Sigma公司,纯度均大于98%,用25 mmol/L磷酸配成2 mg/mL标准储备液,所有样品溶液均避光保存于4 ℃的冰箱中;无水磷酸氢二钠、磷酸、三乙胺、乙醇、甲醇、溴苯、四氯化碳、三氯甲烷、氯化钠 国药集团化学试剂有限公司,分析纯;乙腈 美国Fisher Scientific公司,色谱纯。

LC-20AT高效液相色谱仪 配置紫外可变波长检测器与自动进样器,日本岛津公司;Phenenomenex Tc-C18色谱柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm) 美国菲罗门公司;Millipore Simplicity 185超纯水机 美国默克密理博公司;XYJ80-1离心机 金坛恒丰仪器厂;HYQ-2110涡旋混匀器 南京畅翔仪器设备有限责任公司;100 μL微量进样器 上海高鸽工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 在15 mL具塞玻璃离心管中加入10.0 mL FQs混合标准溶液,再加入1 mL 0.025 mol/L磷酸氢二钠(pH=7)、800 μL乙腈(分散剂)、500 μL三氯甲烷(萃取剂)。振荡2 min,使管内形成均匀的乳浊液体系,以3000 r/min转速离心3 min,有机相沉降到离心管底部。将离心管底部的萃取剂全部抽取至0.5 mL的离心管中,N2吹干后,沿管壁加入25 μL流动相复溶,涡旋均匀。用微量进样器吸取20 μL进样分析。

1.2.2 色谱条件 色谱柱:phenenomenex Tc-C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm);流动相:V乙腈∶V(0.5%三乙胺、pH=2.5)=17∶83(流动相经过0.45 μm微孔滤膜过滤和超声脱气处理);流速1.0 mL/min;检测波长280 nm;柱温30 ℃。

1.2.3 萃取剂种类的选择 DLLME使用的萃取剂密度需比水大,以便于后续的离心分相,还需要对分析物有良好的萃取能力。基于上述特点,分别考察二氯化碳、三氯甲烷、四氯化碳、溴苯这四种萃取剂对FQs的萃取效果。萃取剂的用量是200 μL,乙腈做分散剂,用量是800 μL,萃取体系pH=7,其它条件同1.2.1所示。

1.2.4 萃取剂的用量 以三氯甲烷为萃取剂,分别选择150、200、250、400、500、700 μL六种不同体积,考察不同的萃取剂用量对FQs萃取效率的影响。乙腈做分散剂,用量是800 μL,萃取体系pH=7,其它条件同1.2.1所示。

1.2.5 分散剂种类的选择 以三氯甲烷为萃取剂,用量为500 μL,选择甲醇、丙酮、乙腈、乙醇四种分散剂,考察分散剂种类在DLLME中对FQs萃取体系的分散效果。分散剂的用量是800 μL,萃取体系pH=7。其它条件同1.2.1所示。

1.2.6 分散剂的用量 以三氯甲烷为萃取剂,用量为500 μL,乙腈为分散剂,分别选择200、400、600、800、1000、1200 μL六种水平,考察不同的分散剂用量对FQs萃取效率的影响。萃取体系pH=7,其它条件同1.2.1所示。

1.2.7 pH的影响 以三氯甲烷为萃取剂,用量为500 μL,乙腈为分散剂,用量为800 μL。以不同pH的磷酸氢二钠溶液调节DLLME萃取体系的pH,考察在pH=6～9范围内FQ的萃取效果。其它条件同1.2.1所示。

1.2.8 方法学考察 配制系列标准溶液,考察方法的线性范围;检出限(LOD)按S/N=3计算;对200 μg/L的FQs标准溶液在日内和日间分别平行测定6次,考察方法重现性。以分析物被萃取前后色谱峰相对面积之比计算富集倍数。

1.2.9 实际样品测定 汉江水、鱼塘水及自来水经0.45 μm滤膜过滤后,各取10 mL置于15 mL具塞玻璃离心管中,各加入低浓度、高浓度两个水平标准FQs溶液,再按1.2.1所述方法进行处理,计算加标回收率及FQs实际含量。色谱分析数据以汉江水加高浓度水平FQs溶液萃取分析为例。

1.2.10 数据处理 考察萃取剂、分散剂的种类与用量、pH等因素,将萃取后由HPLC测得的6种FQs峰面积及各因素水平导入Origin 8.5软件,制作折线图或柱形图,用于直观比较各因素水平对萃取效果的影响。

2 结果与分析

2.1 DLLME的建立

DLLME使用的萃取剂需要对分析物有良好的亲和性,且有良好的色谱行为。在对FQs萃取条件考察的过程中,发现采用三氯甲烷做萃取剂,萃取完成后直接进液相色谱仪分析,色谱峰严重变形,影响了检测灵敏度。

因此,本实验在DLLME后将萃取剂全部抽出,经N2吹干后用微量流动相复溶浓缩,和HPLC联用,测定实际水样中的六种FQs,较好地改善了色谱峰形,提高了检测灵敏度。

2.2 萃取条件的考察

2.2.1 萃取剂的选择 经初步实验,在选定色谱条件下,二氯化碳与分散剂混合后,液滴损失严重。在同等条件下,萃取完成后将萃取剂全部抽出经N2吹干加入25 μL流动相复溶后,三氯甲烷做萃取剂可以获得最高的萃取效果(图1)。本实验最后选择三氯甲烷作为萃取剂。

图1 萃取剂种类的选择Fig.1 Optimization of the type of extractant

2.2.2 萃取剂用量的影响 在同等条件下,三氯甲烷用量在150～700 μL范围内,萃取效率随着萃取剂用量的增加而增加(图2)。原因是随着三氯甲烷用量的增大,进入有机相的分析物越来越多,但是随着三氯甲烷用量越大,N2吹干耗用时间越长,复溶时流动相沿管壁加入后,涡旋溶解均匀难度增大。综合以上原因,实验选用三氯甲烷用量为500 μL。

图2 萃取剂用量的影响Fig.2 Optimization of the extractant volume

2.2.3 分散剂的选择 分散剂的种类是影响萃取效率的另一关键因素,分散剂的极性应介于水和有机相之间,且能与萃取剂和水互溶。这样可以使萃取剂在水相中分散成细小的液滴,形成水/分散剂/萃取剂的乳浊液体系。结果表明,丙酮的溶剂峰过大,对分析物的干扰严重;甲醇、乙腈、乙醇可以很好地将三氯甲烷分散,色谱行为良好,不干扰测定。如图3所示,乙腈做分散剂时,萃取效果最好,且和流动相匹配,故实验选用乙腈做分散剂。

图3 分散剂种类的选择Fig.3 Optimization of the type of dispersant

2.2.4 分散剂用量的影响 分散剂用量直接影响乳浊液体系的形成,影响萃取剂在水中的分散程度,从而影响萃取效率(图4)。分散剂用量过少,不能很好的形成乳浊液,萃取效率低;用量过大,则会降低分析物在萃取剂中的分配系数,降低萃取效率。乙腈用量在800 μL时萃取效率最高,故分散剂用量选用800 μL。

图4 分散剂用量的影响Fig.4 Optimization of the dispersant volume

2.2.5 pH的影响 FQ结构上有羧基和哌嗪基,溶液的pH不同,其分子中氨基和羧基的带电情况不同,可以成正离子、负离子和中性分子[10]。当FQ以中性分子状态存在时,其在有机相中的分配系数提高,萃取效率增大。显然,pH对FQ的萃取效果有一定的影响。如图5所示,当pH=7时,大多数的FQs以中性分子的形式存在,且与三氯甲烷萃取剂的分配系数最高,从而表现高的萃取效率。实验选用样品溶液的pH为7。

图5 酸度的影响Fig.5 Optimization of pH

2.3 线性范围、检出限、精密度、富集倍数

线性范围、检出限、方法重现性(RSD)、富集倍数结果见表1。与常规的分散液液微萃取法(DLLME)[5]、聚合物整体柱微萃取(PMME)[11]、固相萃取法(SPE)[12]、离子液体液相微萃取法(I-LLME)[13]法比较了有关分析灵敏度。由于本方法经过了N2吹干再复溶浓缩的过程,灵敏度高是其显著优点,尤其是氧氟沙星的检出限为0.075 μg/L,远低于其他几种方法,司帕沙星虽然有较高的富集倍数,但是由于其出峰时间较晚,峰形展宽较严重,导致其检出限相对其他FQs略高。

表1 6种FQs的线性方程、检出限、精密度和富集倍数Table 1 Linear equation,limit of detection,RSD and enrichment factor for six FQs

注:A:PMME法;B:DLLME法;C:I-LLME法;D:SPE法。

表2 样品测定结果Table 2 Analytical results of samples

注:ND:未检出。

2.4 实际样品测定

汉江水的加标色谱图见图6。

图6 样品测定色谱图Fig.6 Chromatograms of sample determination注:汉江水加标(200 μg/L)。

为了考察样品基质对测定的影响,做了两个浓度水平的加标回收实验,结果见表2。实际样品的加标回收率在88.6%～109.3%之间,表明样品基质对分散萃取并无显著影响。鱼塘水中检出2种FQs的原因是由于其作为兽药类抗生素在使用,而汉江水中仅检测到一种FQs抗生素,且浓度远远低于鱼塘水,说明汉江水系由于流动性强、面积大,有利于稀释进入汉江水系的FQs。

3 结论

建立了一种DLLME-HPLC同时测定水样中6种FQs的方法。该方法对6种FQs加标回收率可达88.6%～109.3%,检出限可达0.075～0.34 μg/L,相对标准偏差不高于5.8%。采用在萃取结束后将萃取剂全部抽出,N2吹干后再用微量的流动相复溶浓缩后进行测定,改善了常规DLLME萃取剂后直接进样和流动相不相容导致色谱峰变形、灵敏度降低的缺点,具有灵敏度高、简便、准确、环境友好等特点,在水样中FQs药物分析中有一定的推广应用价值。

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Determination of fluoroquinolones in water with dispersive liquid-liquid phase microextraction-HPLC

WANG Zhen-zhong1,2,3，TANG Shang-wen4，FAN Jing1,2,3,*

(1.Pharmacy College of Hubei University of Medicine,Shiyan 420000,China； 2.Engineering Research Center for Herbal Utilization of Hubei Province,Shiyan 420000,China； 3.Key Lab of Wudang Characteristic Herbal Study in Hubei Province,Shiyan 420000,China； 4.Chemistry and Food College of Hubei University of Arts and Science,Xiangyang 441053,China)

Dispersive liquid-liquid micro-extraction coupled with high performance liquid chromatography(DLLME-HPLC)was applied to separate and determine six fluoroquinolones(FQs)in aqueous samples. Before injection into HPLC,the extraction solvent droplet obtained after centrifugation was pulled out,and then dried by nitrogen flow,re-dissolved with dozens of microliters mobile phase at last. Some important parameters,like variety and dosage of extractant and dispersive solvent and pH of extraction solution,which influent the extraction efficiency were investigated. The results showed that after adding 500 μL trichloromethane as extractant solvent,800 μL acetonitrile as dispersive solvent into extraction system which pH was tuned to 7,enrichment factor of 6 FQs was up to 245 and a good linear relationship was obtained in the range of 0.075～0.34 μg/L. The recoveries of 6 FQs in 3 kinds of water from han river,fishpond and running water fell in the range from 88.6% to 109.3% and the relative standard deviation was less than 5.8%. The method had low matrix effect,high enrichment factor and avoids chromatographic peak deformation when direct injection of extraction solvent droplet in the traditional DLLME. It was proven to be sensitive,simple,and accurate in residue analysis of FQs in water.

fluoroquinolones;HPLC;DLLME;water samples

2016-09-02

王振忠(1982-)，男，博士，讲师，研究方向：液相色谱分析方法，E-mail：shilywzz@163.com。

*通讯作者:樊靓(1981-)，女，博士，讲师，研究方向：新型分析检测方法开发，E-mail：zone125@163.com。

湖北省教育厅项目(B2016142);十堰市科技局项目(16Y04，16Y05);湖北省“三区”人才支持计划；湖北医药学院创新团队项目(FDFR201602)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)08-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.001