核桃青皮乙酸乙酯提取物对烟蚜的防治作用

何念武，赵秦，魏佳乐

（商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西商洛 726000）

烟蚜（Myzus persicae），又名桃蚜，属于昆虫纲同翅目蚜科昆虫，遍布世界各地，在我国华北地区每年发生10余代，南方则高达30～40代，世代重叠极为严重，繁殖速度非常快，严重危害我国各产烟区烟草作物的正常生长，给广大烟叶种植区带来了严重危害。一直以来，对烟蚜的防治主要依赖化学农药，在一段时期内，化学防治法占据着主导地位，但是随着化学农药的日益滥用，其负面影响也逐渐显现，诸如烟蚜产生了明显的抗药性，杀伤烟蚜天敌，生态失衡和严重的环境污染等问题[1-2]。为了解决这一突出问题，广大研究人员将目光转向了生物防治。首先从植物中提取活性成分，继而通过一定手段将其制成生物农药以便用于烟草病虫害防治，取得了明显的成效[3]。

核桃青皮，药材名为青龙衣(Cortex Juglans Mandshuricae)，始载于《开宝本草》，为核桃未成熟果实的外果皮，夏末秋初采收，脱皮机切制而成，再晒干或烘干。据报道核桃青皮中富含胡桃醌、多糖等活性成分[4-5]，具有镇痛、抗癌、抑菌等功效[6-7]。商洛作为全国主要核桃产地，对于核桃副产物核桃青皮的研究则甚少，更谈不上综合开发利用。鉴于此，本文拟开展核桃青皮乙酸乙酯提取物的分离制备，继而探讨其对烟草蚜虫的生物防治作用，以实现废弃资源再利用和效益的最大化。

1 材料与方法

1.1 材料

核桃青皮，采自商洛市洛南县古城镇中山村(N 34°1′29″；E 110°33′3″，海拔 800～1215 m)，烟苗、烟蚜于2016年5月源于洛南县永丰冀洼村烟叶基地。农药吡虫啉，购于江苏克胜集团股份有限公司，乙酸乙酯等试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理

将采集的核桃青皮自然晾干或放置于烘箱中烘干，干燥后粉碎，过60目筛，粉末储存备用。

1.2.2 乙酸乙酯提取物制备及含量测定

准确称取核桃青皮粉末100 g，加5倍量乙酸乙酯于25℃下浸泡24 h，然后超声辅助回流提取，每次超声提取30 min，抽滤，残渣用4倍量乙酸乙酯反复提取，重复3次。合并3次滤液，萃取，浓缩，干燥，备用。

采用高效液相色谱法（HPLC）测定提取物中胡桃醌含量[8]。

1.2.3 烟草蚜虫的饲养

供试烟蚜收集于陕西省洛南县冀洼烟叶种植基地，挑选形态大小较一致、体型健硕的烟蚜作为实验供试虫，饲养于昆虫饲养笼内。

1.2.4 乙酸乙酯提取物对烟蚜的防治效果测定

1）对烟蚜的毒杀作用测定方法：采用梁永锋[9]的喷雾法进行并做适当调整，加大实验重复次数和供试烟蚜数量。将配制好的系列样品溶液（1.0～20.0 mg·mL-1）均匀喷洒在事先剪好的烟叶上，以每皿100片烟叶和20头烟蚜为一个实验单位。取直径14 cm清洗干净的培养皿15个，铺上滤纸和大小一致的烟草叶片，将供试烟蚜放入培养皿中，不盖皿盖，用四层纱布封闭以防烟蚜逃逸。以10 mg·mL-1市售农药吡虫啉作为阳性对照，乙酸乙酯溶液为正常对照组。置于昆虫饲养笼中放置在事宜的条件下分别培养24 h和48 h后，观察烟蚜死亡情况，烟蚜死亡率和校正死亡率的计算公式分别为：

死亡率=(死亡烟蚜数/供试烟蚜总数)×100%

校正死亡率=［(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)］×100%

2）对烟蚜拒食活性的测定方法：样品配置和实验分组安排同1.2.4中1）。不同之处在于烟叶裁剪时面积是之前的5倍，实验前将烟叶分别浸蘸样品溶液10 s后取出，在烟叶背部放置10头烟蚜，其余操作同1.2.4中的1），分别在饲养24 h和48 h后观察各实验处理叶片上烟蚜的栖息数量，每处理重复5次，拒食率的计算公式为：

拒食率（%）=1-处理叶片烟蚜数/对照叶片烟蚜数×100%

3）作用时间对烟蚜拒食活性的影响评价方法

参照文献[8]的方法进行。

1.3 数据处理与统计分析

数据处理采用2016版Excel进行，统计分析采用SPSS 19.0统计软件进行。

2 结果与分析

2.1 核桃青皮提取物中胡桃醌的含量

由图1可以看出，胡桃醌标品色谱峰在22.0～22.5 min出现，而提取物色谱图出峰较多，主要是含有其他成分的缘故。由外标法计算出乙酸乙酯提取物中的胡桃醌含量为24.5 mg·g-1。

2.2 乙酸乙酯提取物对烟蚜毒杀作用

由表1可知，不同浓度的乙酸乙酯提取物在作用24 h后，对烟蚜有明显的毒杀作用，随着提取物浓度的升高，其死亡率和校正死亡率都在升高，呈现出良好的剂量-效应关系。正常对照组毒杀作用不明显，而阳性对照组的作用效果较明显。当提取物浓度为20 mg·mL-1时，死亡率和校正死亡率最高，死亡率为43.13%，校正死亡率为 42.56%，其毒杀效果略高于阳性对照组。

图1 胡桃醌和核桃青皮提取物HPLC图

不同浓度乙酸乙酯提取物作用48 h后，毒杀效果比24 h的更加明显。这说明提取物的毒杀作用不仅与浓度有关，也与时间有关，这为后续探究相同浓度在不同时间对烟蚜的拒食活性提供了依据。从表1中可以看出，当提取物浓度为20 mg·mL－1，在处理 48 h 后，毒杀活性最高，死亡率为66.35%，校正死亡率为65.81%。正常对照组毒杀效果依旧不明显，与阳性实验相比较，提取物浓度为20 mg·mL－1时，毒杀作用效果更明显，校正死亡率和死亡率都比较高。

表1 核桃青皮提取物对烟蚜的触杀作用/%

2.3 核桃青皮提取物对烟蚜的拒食活性

从表2中可以看出，核桃青皮乙酸乙酯提取物不同浓度对烟蚜的拒食作用有明显的影响，作用24 h后，随着浓度升高，拒食活性逐渐增大。阳性对照组拒食率相对较高，与之前的毒杀作用实验相比，拒食活性实验也存在良好的剂量-效应关系，而正常对照组的拒食率相对很低，对烟蚜几乎没有影响。

当提取物浓度为20 mg·mL-1时，处理48 h后拒食率最高，为70.22%，拒食率略高于阳性对照组。而正常对照组的拒食率在24 h和48 h时都很低，对烟蚜几乎没有影响。阳性对照组随时间的增加，对烟蚜的拒食率也在逐渐升高。

在研究不同浓度提取物对烟蚜的毒杀作用和拒食活性实验中，也存在一定的时间-效应关系，但是由于只设定了24 h和48 h两个时间段。为了更好的说明这一点，继而对作用时间进行了考察，从表3中可以看出，同一浓度的提取物在不同时间内对烟蚜有一定的拒食活性，随着时间的不断延长，拒食率越来越高，在48 h时，拒食率达到最高为42.3%，在72 h后拒食率又降低。这说明在一定的时间范围内，核桃青皮的提取物对烟蚜存在时间-效应关系。阳性对照组的拒食率随着时间的推移，也在升高；正常对照组几乎没有太大变化。

表2 烟蚜对不同浓度的核青青皮提取物的拒食率/%

表3 作用时间对烟蚜的拒食率/%

3 结论与讨论

不同浓度的乙酸乙酯提取物在相同时间以及同一浓度不同时间均会对烟蚜产生不同程度的毒杀和拒食活性，随着浓度和时间的不断增大或延长其毒杀作用和拒食活性都在逐渐增大，并且呈现出较好的量效关系，说明核桃青皮乙酸乙酯提取物对烟蚜有较好的防治效果。

本文系统探究了核桃青皮乙酸乙酯提取物不同浓度和不同作用时间对烟草蚜虫的生防作用，结果表明，核桃青皮乙酸乙酯提取物对烟蚜具有很好的毒杀作用和拒食活性，这与文献[8]颇有异曲同工之处，不同的是文献[8]中采用的是氯仿作为提取溶剂，并且本文研究结果要明显优于文献[8]。另外，与梁永锋等[9]研究相比，本文充分考察了作用时间和浓度对防治效果的影响。此外，王宏虬等[10]虽然也考察了核桃青皮不同溶剂提取物对马铃薯蚜虫的防治作用，但未充分考察乙酸乙酯提取物作用时间对马铃薯蚜虫的综合防治效果。因此，本研究在一定程度上能够为烟草病虫害的生物防治提供参考。

参考文献：

[1]STROM B L,SMITH S L,BROWNIE C.Attractant and disruptant semiochemicals for Dendroctonus jeffreyi(Coleoptera：Curculionidae：Scolytinae)[J].Environ mental Entomology,2013,42(2)：323-332.

[2]ALI J G,ALBOM H T,CAMPOS H R,et al.Subterranean,herbivore-induced plant volatile increases biological control activity of multiple beneficial nematode species in distinct habitats[J].PLoS One,2012,7(6)：3814-3816.

[3]张瑞,韦学义,刘璐,等.青龙衣化学成分及药理活性研究进展[J].世界最新医学信息文摘,2013(35)：5-7.

[4]LI X F.Progress of research on the chemical components and pharmaceutical action of walnut green husk[J].Food Science and Technology,2007(4)：241-242.

[5]蒋丽萍,刘宝瑞,胡文静.青龙衣的化学成分及其抗肿瘤作用的研究进展[J].现代肿瘤医学,2014(11)：2735-2737.

[6]王海香,申照静,杜娟,等.核桃青皮提取物对朱砂叶螨的毒力及相关酶活性的测定[J].林业科学,2008,44(5)：70-74.

[7]HOSSEINZADEH H,ZAREI H,TAGHIABADI E.Antinociceptive,anti-inflammatory and acute toxicity effects of Juglans regia L.Leaves in mice.[J].Iran ian Red Crescent Medical Journal,2011,13(13)：27-33.

[8]何念武,凤高峰,黄金辉.核桃青皮氯仿提取物对烟蚜的防治研究[J].商洛学院学报,2017,31(4)：66-70.

[9]梁永峰.核桃青皮提取物对萝卜蚜虫毒杀和拒食活性研究[J].江苏农业科学,2011,39(2)：187-188.

[10]王宏虬,缪福俊,李彪,等.核桃青皮提取物对马铃薯蚜虫与瓢虫的杀虫活性[J].江苏农业科学,2012,40(7)：112-114.