荧光探针检测水中F-研究

刘倩，白星星

（商洛学院化学工程与现代材料学院/陕西省尾矿资源综合利用重点实验室，陕西商洛 726000）

氟化物可以用于牙齿保健、治愈骨质疏松症以及制备化学试剂，因此它在生物、医学和化学进程中发挥着重要作用。但是人体氟过量会导致氟中毒，轻者造成氟斑牙，重者引起氟骨症，甚至完全丧失劳动和生活自理能力。且氟中毒一旦患上即永远成疾[1-3]。因此，近年来，氟离子的检测越来越受到人们的关注。荧光分析法因其具有操作简便、选择性好、灵敏度高、取样量少、线性范围宽等优点，在药物分析、DNA排序、食品的微量和痕量分析以及生物科学等领域得到了广泛的应用[4-6]。近年来，人们尝试将荧光探针应用于药物分析、临床诊断、遗传分析、细胞检测、环境监测等方面，并取得了显著成果。目前，用于检测氟离子的荧光探针已有大量文献进行报道，主要基于以下几种反应机理：断裂Si-O键；断裂Si-C键；基于氟离子诱导Si-O键断裂合环反应；与有机硼化合物相互作用等[7-9]。基于氟离子对硅具有很强的亲和力，诱导硅醚键断裂的原理。本文设计、合成一种新型F-荧光探针1-(2-叔丁基二甲基氯化硅烷基-4-吡咯基)-苯乙烯基丙二腈（PB-1），利用叔丁基二甲基氯化硅化合物对化合物的羟基进行保护，从而抑制激发态分子内质子转移（ESIPT）过程。而加入氟离子后，氟离子选择性地切割探针中的叔丁基二甲基硅基，释放出羟基，ESIPT过程恢复，从而实现对氟离子的检测。本文还考查了该荧光探针对F-的识别能力，包括反应时间、灵敏度、选择性及pH的影响。并讨论它对水中F-检测的可能性。

1 实验部分

1.1 实验试剂和仪器

间氯苯酚、三氯氧磷、二甲基甲酰胺、氯仿、吡咯烷、二甲基亚砜、碳酸钾、三乙胺、叔丁基二甲基氯硅烷、丙二腈、哌啶、二氯甲烷、无水乙醇、氢氧化钾、硝酸。

紫外可见分光光度计、F4600荧光分光光度计、磁力搅拌器、电子分析天平、旋转蒸发仪、电子分析天平。

1.2 实验原理

荧光探针1-(2-叔丁基二甲基氯化硅烷基-4-吡咯基)-苯乙烯基丙二腈，简称PB-1，结构如图1所示。探针PB-1中的羟基被叔丁基二甲基氯硅烷保护后，激发态分子内质子转移（ESIPT）过程被抑制，荧光很弱，而加入F-后可以选择性的断裂硅醚键，生成的氧负离子与邻位的α，β-不饱和腈分子发生分子内的1，2-亲核加成反应，生成异香豆素类化合物，使ESIPT过程恢复，荧光增强，如图2所示。

图1 PB-1的分子结构式

1.3 PB-1合成路线

PB-1的合成路线如图3所示。

图2 PB-1与F-反应的原理图

图3 荧光探针PB-1的合成路线

1.4 实验检测条件

称取适量的探针PB-1进行真空干燥后溶于乙腈溶液中，定容至100 mL，配制成测试所需要的合适浓度。各种常见物质（Br-，I-，NO2-，NO3-，CO32-，ClO4-，Cl-，SO42-，H2PO4-，SCN-，Cys，AcO-，GSH，Hcy，F-）配制成测试所需浓度的水溶液。测试体系：乙腈-HEPES 缓冲液，20 mol·mL-1，pH=7.4，v/v=4：1。荧光分光光度计参数如下：λex=445 nm，Em的狭缝宽度为5.0 nm，激发电压为700 v。

2 结果与分析

2.1 紫外、荧光光谱分析

2.1.1 紫外可见吸收光谱

实验分别测试了荧光探针PB-1（10 μmol·L-1）及PB-1与F-（v/v=1：1，10 μmol·L-1）反应40min后的紫外-可见吸收光谱图，结果如图4所示。由图4可知，PB-1在435 nm处有一个宽的收峰处，当它与同体积同浓度的F-反应40 min后，最大吸收峰红移至445 nm处，且吸光度减弱。表明F-诱导探针PB-1中的硅醚键断裂，发生了羟基脱保护反应，生成的氧负离子与邻位的α，β-不饱和腈分子发生分子内的1，2-亲核加成反应，生成了亚胺阴离子中间产物，该中间产物又迅速从溶液中得到质子而形成了新的物质，此现象与原理所述一致。

图4 紫外-可见吸收光谱图

2.1.2 荧光发射光谱

1）荧光光谱与时间的关系

实验考察了时间与荧光强度的关系，将荧光探针PB-1与F-（v/v=1：1，10 μmol·L-1）混合，每隔10 min测试荧光强度，一直测到反应后1 h，荧光强度随时间变化的曲线如图5、图6所示。

图5 荧光发射光谱随时间的变化

图6 荧光强度在最大发射波长处（488 nm）随时间的变化

由图5和图6可以看出，荧光探针PB-1与F-反应后生成的化合物在488 nm处吸收强度达到最大，PB-1与F-反应时间在20 min内，荧光强度增加较迅速，20～40 min增加较缓慢，40 min后荧光强度不再增加，趋于稳定。即反应达到饱和的时间为40 min。

2）荧光光谱与浓度的关系

将荧光探针 PB-1（10 μmol·L-1）与不同浓度（0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39 μmol·L-1）的 F-反应 40 min，荧光强度的变化如图7所示。由图7可以看出，F-的浓度为0时，荧光强度很弱，随着F-的浓度不断增大，在488 nm处出现最大发射峰且荧光强度不断增强，当 F-的浓度达到 27μmol·L-1时，即探针 PB-1的 2.7倍时，荧光强度达到饱和，不在随着F-浓度的增大而增加，最大增强为荧光探针PB-1的108倍。在紫外灯的照射下，探针呈现出较强的黄绿色荧光。

图7 荧光强度随F-浓度增加的变化

由图 8 可知，当 F-的浓度为 0～24 μmol·L-1，荧光探针PB-1浓度为10 μmol·L－1时，荧光强度与F-的浓度有较好的线性关系。线性方程为y=266.8x+71.588，其拟合常数R为0.9988。F-的检测下限达到10 μmol·L－1，显示了较高的检测灵敏度。

图8 荧光强度与F-浓度的线性关系

2.2 其他离子干扰测试分析

将荧光探针 PB-1（10 μmol·L-1）分别与20 倍的 Br-，I-，NO2-，NO3-，CO32-，ClO4-，Cl-，SO42-，H2PO4-，SCN-，Cys，AcO-，GSH，Hcy 反应40 min后的荧光强度如图9所示。可以看出，只有加入F-，荧光强度才会显著增加，是未加物质空白溶液的108倍。而加入其它阴离子及巯基化合物后，荧光强度并未增加或增加很小（可忽略），说明荧光探针PB-1对F-有较好的选择性。

为了进一步探讨该方法测定F-的可行性，实验考察了共存物质对F-测定的影响，如图10所示，加入浓度为PB-1 200倍的共存物质对2.7倍的F-几乎没有干扰。这表明F-仍能选择性的脱去PB-1中的叔丁基二甲基硅基官能团，探针PB-1可以实现复杂样品中F-的检测。

图9 加入不同阴离子及巯基化合物后荧光强度的变化

图10 干扰物质与F-共存时对PB-1的发射光谱的影响

2.3 pH值的影响

实验考察了加入F-前后，pH对PB-1荧光强度的影响，利用KOH和HNO3将溶液调制成pH=4，5，6，7，8，9 的测试体系，将探针 PB-1 配置成浓度为 1×10-5mol·L－1的溶液并测试其荧光强度，且分别往里面加入相同体积相同浓度的F-，反应40 min后，测试其荧光强度，如图11所示。

图11 加入F-前后不同pH条件下的荧光强度

由图11可以看出，pH在4.0～9.0，探针PB-1荧光强度保持不变，说明探针PB-1可以在较宽的pH值范围内稳定存在，而加入F-后，荧光强度都会增加，表明PB-1可以在较宽的pH值范围内检测F-。但在pH为4、5时，荧光强度增加比较小，在 pH 为 6、7、8、9 时，荧光强度增加比较大，尤其在pH为7时，荧光强度增加最为显著。因此，pH为7作为最佳测试条件。

3 结论

本文基于氟离子对硅具有很强的亲和力，可以诱导硅醚键断裂的原理。设计并合成一种新型的F-荧光探针PB-1，实验对其光谱性质、选择性、pH等进行研究，发现加入F-后，光谱性质变化明显，紫外可见吸收波长由435 nm红移到445 nm；并且荧光光谱在波长为488 nm处强度不断增强，最大增强为108倍。通过对pH和选择性的测试，发现它可以在不受其它离子干扰的情况下，在一个较宽的pH范围内检测F-。且测试体系中有机溶剂的含量仅为5%，因此，PB-1可用于水中F-的检测。

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