一组耐低温纤维素降解菌系培养条件优化及产酶分析

郑国香，赵欣，李健

（1.东北农业大学工程学院，哈尔滨150030；2.农业部生猪养殖设施工程重点实验室，哈尔滨150030；3.寒地农业可再生资源利用技术与装备重点实验室，哈尔滨150030）

一组耐低温纤维素降解菌系培养条件优化及产酶分析

郑国香1,2,3，赵欣1,2,3，李健1,2,3

（1.东北农业大学工程学院，哈尔滨150030；2.农业部生猪养殖设施工程重点实验室，哈尔滨150030；3.寒地农业可再生资源利用技术与装备重点实验室，哈尔滨150030）

针对东北寒区冬季沼气发酵水解效率低下问题，从土壤中定向筛选一组耐低温纤维素降解菌系LTF-27。利用间歇试验，通过Box-Benhnken中心组合设计和响应面分析法（RSM），优化其稻秆水解培养条件。反应装置有效体积300m L，底物唯一碳源为2 g·L-1水稻秸秆，温度控制在（17±1）℃、摇床转速100 r·min-1，培养13 d。通过单因素和中心组合试验确定主要影响因素及优化组合为水稻秸秆2 g·L-1，(NH4)SO41.5 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，酵母浸粉1 g·L-1，MgSO40.057 g·L-1，CaCO31.49 g·L-1，K2HPO40.75 g·L-1。优化后低温条件下稻杆降解率可达64.51%，提高10.2%。利用分光光度法对复合菌系LTF-27产酶结果分析表明，该菌系可将纤维素降解为简单糖完整纤维素酶系，酶系中3种关键酶产酶过程相似，β-葡萄糖苷酶酶活（最大值3.4 IU·mL-1）较内切葡聚糖酶活（Cx）（最大值8.5 IU·mL-1）、外切葡聚糖酶活（C1）（最大值7.9 IU·mL-1）活性低。

纤维素；耐低温；复合菌系；优化

郑国香,赵欣,李健.一组耐低温纤维素降解菌系培养条件优化及产酶分析[J].东北农业大学学报,2017,48(4):61-68.

Zheng Guoxiang,Zhao Xin,Li Jian.Optimization o f cu lture conditions and enzyme analysis of low tem perature-resistant ce llulose degradation com pound strains[J].Journa lof NortheastAgriculturalUniversity,2017,48(4):61-68.(in Chinese w ith Eng lish abstract)

我国农林作物纤维资源丰富，但纤维素结构复杂、难降解[1]，露天堆放并燃烧浪费资源、污染环境[2]。目前，以生物技术开发和利用生物质资源，成为解决能源与环境问题重要途径之一[3]。

沼气发酵及生产受环境因素影响，东北寒区冬季漫长气温低下，在发酵过程中，秸秆降解产酸阶段是沼气发酵关键限速步骤。因此，筛选和开发耐低温纤维素降解菌系，优化培养条件，提高秸秆底物水解能力，对寒区生物质利用具有重要意义[4]。近年来，耐低温纤维素降解微生物研究针对单一菌株展开探讨。李春燕等采用富集培养方法筛选1株可降解纤维素细菌，鉴定为节杆菌属（Arthrobacter sp.）细菌[5]；高云航等从长白山冻土中分离1株产低温纤维素酶活力较强菌株NF3-2，鉴定其属于椭圆葡萄孢菌（Botrytis elliptica strain lily）[6]；穆春雷等在秸秆还田土壤中筛选分离一株低温条件下高产纤维素酶真菌M 11，鉴定为草酸青霉（Penicillium oxalicum）[7]。吕明生等在海泥中分离1株产纤维素酶菌株Z6，经鉴定为交替假单孢菌属（Pseudoalteromonas sp.）[8]。与单一菌株相比，复合菌系具有菌种多样、菌种间协同作用等优点，对反应环境具有较强适应性和协同性，在沼气发酵研究领域引起关注。

本文通过单因素试验与中心组合试验，优化获得一株耐低温木质纤维素降解菌系LTF-27培养条件，获取最佳稻杆降解率，以期为利用该菌复合菌强化稻秆水解产酸相，提高后续产甲烷相气体产率奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌种

本试验采用东北农业大学生物质能源中心筛选的耐低温木质纤维素降解复合菌系LTF-27。

1.1.2 培养基

基础培养基：蛋白胨5 g、氯化钠5 g、碳酸钙3 g、酵母粉1 g、蒸馏水1 000mL、经处理稻秆2 g。121℃灭菌20min。

稻秆预处理：先将稻秆浸泡在1%NaOH溶液中24 h，清水反复冲洗，于100℃烘箱烘干，剪1～2 cm段[9]。

1.1.3 供试药剂

（NH4）SO4，FeSO4，ZnSO4，MgSO4，CuSO4，CaCO3，K2HPO4，KH2PO4，柠檬酸钠缓冲溶液、DNS试剂、葡萄糖标准溶液等，试剂均为分析纯。

1.1.4 粗酶液制备

取适量水解液，于3500 r·min-1条件下离心20min，取上清液为粗酶液[10]。

1.1.5 培养条件

接种量为5%（V/V），有效发酵体积为300mL，摇床转速为100 r·min-1，温度（17±1）℃培养。

1.2 检测方法

1.2.1 稻秆失重率测定

水解后残余物用纱布过滤，硫酸冲洗纱布中残余物，除去残留菌体和碳酸钙，再用蒸馏水多次冲洗至中性，100℃烘箱中烘至恒重。

1.2.2 纤维素酶活测定

利用DNS法测定纤维素酶活性，具体方法见文献[11-12]。分别取1m L纤维素酶液与上述3种底物溶液2mL混匀。在30℃恒温水浴条件下反应1 h。加入显色剂3mL，立即沸水浴中显色5min，冷却后稀释到10mL。在540 nm处测定OD值，每个反应测定3次，

1.3 试验设计

1.3.1 单因素试验

本试验以水稻秸秆作为唯一碳源，对培养基氮源、微量元素作单因素试验。氮源选取豆粕、玉米粉、麦麸、尿素、硫酸铵、硝酸铵、蛋白胨、酵母浸粉。与水稻秸秆以C/N为30：1配比试验。确定最佳氮源后，分别以CaCO3、FeSO4、MgSO4、ZnSO4、CuSO4、KH2PO4、K2HPO4为单因素试验，质量浓度分别为0.25～1.25 g·L-1、0.01～0.03 g·L-1、0.03～0.11 g·L-1、0.004～0.012 g·L-1、0.1～0.26 g· L-1、0.25～0.5 g·L-1、0.3～0.7 g·L-1。以发酵体系内秸秆降解率为衡量指标，每个试验重复3次，取平均值。

1.3.2 Plackett-Burman试验设计

Plackett-Burman试验可从多个因素中筛选对试验影响较大因子设计试验[13]。研究筛选8个影响因素，每个因素2个水平（-1为低水平，+1为高水平），高水平为低水平1.25倍，各因子水平见表1。利用Minitab软件评价各因素重要性，筛选出显著性较高因素作下一步试验。

1.3.3 最陡爬坡试验设计

响应面拟合方程仅在紧接邻域内可充分拟合真实情况，逼近最佳区域后建立有效响应面拟合方程。最陡爬坡法以试验值变化梯度为爬坡方向[14]。根据PB设计结果，由各因素效应值确定变化步长。按一定梯度增加或者减少各因素水平值，检测稻杆降解率，最高降解率水平值即为响应面分析中心点[15-17]。

表1 Plackett-Burm an设计Table 1 Top design of Plackett-Bu rman (g·L-1)

1.3.4 Box-Behnken设计

选取Plackett-Burman试验筛选3个重要因子MgSO4、CaCO3、K2HPO4作为试验因素，通过最陡爬坡试验设计筛选质量浓度作试验中心点，每个试验因素及其水平分别为MgSO4（0.05、0.055、0.06 g·L-1）、CaCO3（1.3、1.4、1.5 g·L-1）、K2HPO4（0.6、 0.7、0.8 g·L-1），共计15组试验。试验设计见表2。

结合稻秆降解率为响应值的二阶数学模型：

表2 Box-Behnken设计Tab le2 Top design of Box-Behnken (g·L-1)

式中，Y为预测值，即秸秆降解率；A为回归系数；Ai为Xi线性效应；Aii为Xi二次效应；Aij为Xi与Xj之间线性交互效应；k为变量数。

2 结果与分析

2.1 单因素试验分析

8种氮源对耐低温菌系LTF-27降解稻秆影响结果见图1a，无机氮源（NH4）SO4作为氮源更有利于复合菌系LTF-27发酵产酸，稻杆水解率最高，为52.81%。（NH4）SO4单因素试验，结果见图1b，最佳质量浓度为1.5 g·L-1时稻秆降解率最高。

以（NH4）SO4为氮源，分别考查CaCO3、FeSO4、MgSO4、ZnSO4、CuSO4、KH2PO4、K2HPO4等7种元素对复合菌系LTF-27降解稻杆效率影响试验，结果如图1c～i所示。

图1 单因素对秸秆降解影响Fig.1 Effect of single factor on straw degradation

由图1可知，各因素随质量浓度变化呈先增后减趋势。CaCO3在1.0 g·L-1时，降解率最高，为52.91%；FeSO4在0.015 g·L-1时，降解率最高，为53.98%；MgSO4在0.07 g·L-1时，降解率最高，为56.58%；ZnSO4在0.008 g·L-1时，降解率最高，为47.51%；CuSO4在0.18 g·L-1时，降解率最高，为52.91%；KH2PO4在0.3125 g·L-1时，降解率最高，为52.98%；K2HPO4在0.5 g·L-1时，降解率最高，为54.02%。因此，CaCO3、FeSO4、Mg⁃SO4、ZnSO4、CuSO4、KH2PO4、K2HPO4选取质量浓度分别为1.0、0.015、0.07、0.008、0.18、0.3125、0.5 g·L-1最优。

2.2 Plackett-Burnman试验分析

根据单因素试验结果，对8个因素选取适当水平，应用Minitab 17软件P-B试验设计，探讨Ca⁃CO3、FeSO4、MgSO4、ZnSO4、CuSO4、（NH4）SO4、 KH2PO4、K2HPO4等因素对菌株水解稻秆影响，试验设计结果见表3。

在单因素试验基础上，根据P-B试验方法以及Minitab 17等软件作数据统计分析，结果见表4。8个因素中影响显著性顺序为K2HPO4＞CaCO3＞MgSO4＞KH2PO4＞FeSO4＞CuSO4＞ZnSO4＞（NH4）SO4。且K2HPO4（P=0.016）、CaCO3（P=0.021）、MgSO4（P= 0.044）P值＜0.05。对稻秆水解影响显著。确定其为下一步试验关键因子。

2.3 最陡爬坡试验分析

根据Plackett-Burnman试验中K2HPO4、CaCO3、MgSO4因素效应值确定变化方向和步长。由表4可知，MgSO4存在负效应，应减少；K2HPO4、CaCO3存在正效应，应增加。试验设计及结果见表5，可知，第4组稻杆降解率最高。以MgSO40.055 g·L-1、 CaCO31.4 g·L-1、K2HPO40.7 g·L-1作为响应面分析试验中心点。

表3 Plackett-Bu rman试验设计表与结果(N=8)Tab le 3 Design and resu lt of Plackett-Burm an experiment(N=8)

表4 Plackett-Burman显著性分析Table4 Significantanalysisof Plackett-Burman

表5 最陡爬坡试验设计及结果Table5 Design and resultof steepestascentexperiment

2.4 Box-Behnken试验分析

根据Box-Behnken中心组合原理，设计3因素3水平试验，试验设计结果见表6。

运用Design-Expert8.0软件对试验数据二次多项式回归模拟，建立稻杆降解率随MgSO4、CaCO3、K2HPO4变化回归方程：

Y=61.59+7.34A+3.22B+4.22C+2.60AB+2.11AC-4.08BC-10.68A2-2.18B2-5.90C2

方差分析表见表7，可知出回归方程回归项P＜0.05，失拟项＞0.05，说明回归效果显著，失拟效果不显著，方程回归系数R2=0.9496，Radj=0.8851，说明回归方程拟合度较好，可利用该模型预测实际稻杆最高降解率。

表6 中心组合设计因素编码及结果Tab le6 Factors codesand resu ltof central compost design

表7 二次多项模拟方差分析Tab le 7 Analysisof variance and regression for the quadraticm odel

图2 中心组合设计响应面Fig.2 Response sur face p lotof central com post design

根据二项多项式模型，利用Design-Expert8.0软件绘制响应面图[18-20]，见图2。由图2a可知，当MgSO4与CaCO3在点（0.54，0.9）时，菌系降解秸秆效率最高，图2b为MgSO4与K2HPO4交互作用对秸秆降解影响，在点（0.54，0.5）时稻杆降解率最高，经图2c验证结果一致。从图中陡峭情况看，图2a、2b曲面图较2c陡峭，说明MgSO4与CaCO3、MgSO4与K2HPO4交互作用显著，当各因素固定在（0.54，0.9，0.5）时，较大降解率存在曲面中心区域，且区域内存在降解率极值点。经软件分析得出预测模型：MgSO40.057 g·L-1、CaCO31.49 g·L-1、K2HPO40.75 g·L-1，降解率为64.82%。

为验证稻杆降解率响应模型准确性与可靠性，在此条件下，5次试验测定稻杆降解率分别为65.01%、64.22%、63.97%、64.21%、65.14%，平均值为64.51%，比未优化[21]前提高10.2%，与预测值相近，表明该模型可预测试验结果。

2.5 酶系组成分析

利用不同底物，分析复合菌系LTF-27产酶组成，采用羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、水杨苷为底物，检测其酶活。结果见图3。可知内切葡聚糖酶活（Cx）、外切葡聚糖酶活（C1）、β-葡萄糖苷酶在6 d时达最大值（8.5、7.9、3.4 IU·mL-1L）后酶活下降且产酶过程相似，外切葡聚糖酶活（C1）、内切葡聚糖酶活（Cx）3 d后大量分泌，酶活上升速度加快，达到最大值后迅速下降，β-葡萄糖苷酶产酶开始时与其他两种酶相似，3 d后产酶速度变慢，在6～12 d内平缓降低。主要原因是发酵液pH降低，酶活性降低，β-葡萄糖苷酶在后期酶活下降较慢，可能由于低pH造成菌体自溶，胞内和菌体β-葡萄糖苷酶分泌到发酵液中，下降速度变缓[22]。优化后Cx、C1、β-葡萄糖苷酶最大酶活较优化前（Cx 4.34 IU·mL-1、C13.58 IU·mL-1、β-葡萄糖苷酶2.5 IU·mL-1）分别提高1.95、2.2、1.54倍。

图3 发酵过程中纤维素酶各主要成分及变化Fig.3 Com ponents cellu lose com position and change in the fermentation process

3 讨论与结论

目前按照常规方法筛选纤维素降解菌多数最适温度为45～65℃。耐低温降解纤维素细菌降解秸秆效率一般较低，可通过优化提高降解效率。任红梅等在土壤中筛选出一株低温纤维素降解菌M7，通过Box-Behnken中心组合试验和响应面分析法优化后CMC酶活可达4.39 IU·mL-1[11]。胡丽娟等对芽孢杆菌25-2采用最陡爬坡试验，结合中心组合试验及响应面分析确定最优发酵条件，酶活提高1.748倍[23]。王晓林等通过单因素试验及正交试验对菌株YA-14培养条件优化后，酶活提高2.68倍[24]。

在单因素试验基础上，通过Plackett-Burman试验筛选显著影响水解因子为K2HPO4、CaCO3、MgSO4。通过Box-Behnken设计及响应面分析，获得二次多项式方程。通过响应方程回归分析，水解最优培养基组成为：水稻秸秆2 g·L-1，（NH4）SO41.5 g·L-1，NaCl5 g·L-1，酵母浸粉1 g·L-1，Mg⁃SO40.057 g·L-1，CaCO31.49 g·L-1，K2HPO40.75 g·L-1。经试验验证，该条件下最大稻杆降解率为64.51%，较优化前提高10.2%。对比刘甲峰[25]等研究，本研究秸秆降解率是其1.43倍。分析该复合菌系产酶酶系组成，其中具有将纤维素降解为简单糖完整纤维素酶系，酶系中各种纤维素降解酶产酶过程相似且β-葡萄糖苷酶（最大值3.4 IU·mL-1）较Cx酶（最大值8.5 IU·mL-1）、C1酶（最大值7.9 IU·mL-1）活性低。相比于邓芳等[26]筛选ZF-6C（Bacil⁃lus korlensis）菌株，董硕等[27]筛选菌株SWD-28（Penicillium cordubense），该复合菌系产酶完整，耐低温性能强。优化试验后低温纤维素降解细菌降解稻杆周期缩短（由20 d缩短为13 d）[21]。自然条件下，同高温和中温木质纤维素降解菌相比，耐低温复合菌系LTF-27纤维素降解率存在差距，但条件优化可缩短差异。

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Optim ization of culture conditions and enzyme analysis o f low tem perature-resistant ce llu lose degradation com pound strains/ZHENG

Guoxiang1,2,3,ZHAO Xin1,2,3,LIJian1,2,3
(1.Schoo lof Engineering,NortheastAgricultura lUniversity,Harbin 150030,China;2.Key Laboratory of Pig-breeding Facilities Engineering,Ministry of Agricu lture,Harbin 150030,China;3.Heilongjiang Key Laboratory of Techno logy and Equipment for the Utilization of Agricu lturalRenewable Resources,Harbin 150030,China)

Aim ing at solving the low efficiency of biogas ferm entation hydrolysis in northeast cold region of China,a low temperature-resistant cellulose degrading strains LTF-27 was successfully screened from soil.Batch experiments were performed to investigate the optimal hydrolysis conditions by the m ethod of Box-Benhnken central com posite design test and response surface m ethodology (RSM).LTF-27 was cultured w ith a working volume of 300m Lw ith rice straw of 2 g·L-1as sole carbon source.The tem perature was m aintained at(17±1)℃and the rotate speed w as 100 r·m in-1，cu ltivated 13 d.The optimal straw degradation conditions were determ ined by single factor experim ents and Box-Behnken experim entdesign.The optim ized com bination were rice straw 2 g·L-1，(NH4)SO41.5 g·L-1，NaC l5 g·L-1，yeast 1 g·L-1，MgSO40.057 g·L-1,CaCO31.49 g·L-1,K2HPO40.75 g·L-1.The best straw degradation rate was 64.51%,which was 10.2%higher than that of control.Furtherm ore,the enzyme activity of compound strain LTF-27 was analyzed by spectrophotometer w ith time,the results showed that the strains has a com p lete ce llu lase system degrading ce llu lose into sim p le sugars.The enzyme-producing variation trend was sim ilar and the activity of beta glycosidase(max.3.4 IU·m L-1) was lower than thatof Cx(m ax.8.5 IU·m L-1)and C1(m ax.7.9 IU·m L-1).

cellulose;low temperature-resistant;compound strains;optim ization

S141.4；S182

A

1005-9369（2017）04-0061-08

时间2017-4-24 6:20:09[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170424.0620.016.html

2017-03-10

黑龙江省自然科学基金项目（E2015023）；黑龙江省博士后启动基金（LBH-Q13023）

郑国香（1972-），女，教授，博士，硕士生导师，研究方向为农业生物环境与能源工程。Email:zgx720331@126.com