胆固醇对鸡传染性支气管炎病毒感染鸡胚肾细胞的影响

李广兴，赵蕾，陈慧杰，郎跃深，刘鹏，黄小丹，王洪微，任玉东，张瑞莉

（1.黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室，东北农业大学动物医学学院，哈尔滨150030；2.河北省秦皇岛市青龙满族自治县职教中心，河北秦皇岛066500；3.东北农业大学电气与信息学院，哈尔滨150030）

胆固醇对鸡传染性支气管炎病毒感染鸡胚肾细胞的影响

李广兴1，赵蕾1，陈慧杰1，郎跃深2，刘鹏1，黄小丹1，王洪微1，任玉东3，张瑞莉1

（1.黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室，东北农业大学动物医学学院，哈尔滨150030；2.河北省秦皇岛市青龙满族自治县职教中心，河北秦皇岛066500；3.东北农业大学电气与信息学院，哈尔滨150030）

胆固醇是维持细胞膜脂筏稳定结构重要组分。一些囊膜病毒感染过程依赖胆固醇。研究利用Real Time PCR和病毒滴度试验，分析细胞膜和病毒囊膜胆固醇是否影响鸡传染性支气管炎病毒（IBV）感染鸡胚肾（CEK）细胞。结果表明，胆固醇萃取剂甲基-β-环糊精去除细胞膜胆固醇后，可抑制IBV感染CEK细胞并呈剂量依赖性，补充外源性胆固醇后，IBV感染力部分恢复，说明IBV感染依赖细胞膜胆固醇；去除细胞膜胆固醇可影响IBV感染侵入和释放过程。去除病毒囊膜胆固醇对IBV感染力无显著影响。IBV感染CEK细胞时依赖细胞膜胆固醇，而非病毒囊膜胆固醇。

胆固醇；细胞膜；传染性支气管炎；鸡胚肾细胞；感染

鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）为有囊膜单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科冠状病毒属第Ⅲ群，长度27.6 kb[1]。IBV基因组至少有10个开放阅读框（ORF），可编码6.7～440 ku蛋白，病毒RNA各基因排列顺序为：5' UTR-1a-1b-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-3'UTR。除非结构蛋白外主要编码4种结构蛋白，即纤突蛋白（S）、核衣壳蛋白（N）、膜蛋白（M）和小膜蛋白（E）[2]。IBV与宿主细胞结合和进入，需要细胞表面受体与病毒结构蛋白相互作用。IBV感染可引起鸡急性、高度接触性传染病，并引发呼吸道、肾脏、输卵管、肠道及腺胃等多组织器官病变[3]，影响养禽业健康发展。

脂筏是富含鞘磷脂、胆固醇和附属蛋白的特定有序液体微区，在病毒感染和释放过程中发挥重要功能。胆固醇为脂筏主要成分，具有一定硬度和疏水性，可维持鞘脂中饱和脂肪酸链紧密排列，去除后导致脂筏微区结构破坏，影响质膜特性[4]。李咏梅等研究表明，在多种囊膜病毒进入宿主细胞过程中，细胞膜和病毒囊膜胆固醇均发挥重要作用[5]，包括病毒进入、融合、复制、装配和释放[6-7]。猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、牛疱疹病毒1型（BoHV-1）和鼠白血病病毒感染过程需要细胞膜胆固醇[8]。流感病毒和鸭乙型肝炎病毒（DHBV）感染，仅依赖病毒囊膜胆固醇，无需细胞膜胆固醇，犬瘟热病毒需要病毒囊膜胆固醇[9]。水泡性口膜炎病毒（VSV）无需胆固醇[10]。目前IBV感染宿主细胞过程与胆固醇关系尚未见报道。

甲基-β-环糊精为胆固醇结合剂，可抽提生物膜中胆固醇，破坏脂筏完整性。本试验利用甲基-β-环糊精去除膜性结构中胆固醇，通过实时荧光定量RT-PCR和病毒滴度试验研究IBV感染鸡胚肾细胞（Chicken embryo kidney cells,CEKs）时细胞膜和病毒囊膜胆固醇对病毒感染影响，阐明胆固醇与IBV感染相关性。

1 材料与方法

1.1 试验动物和病毒株

IBVM41株由东北农业大学动物医学学院病理解剖教研室保存；SPF鸡胚购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

1.2 主要试剂

甲基-β-环糊精（MβCD）、外源性胆固醇、DNA marker购自大连宝生物试剂有限公司，M199培养液购自Hyclone公司。总RNA极速抽提试剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司，反转录酶购自大连宝生物TaKaRa生物试剂公司；溴化乙锭（Ethidium bromide,EB）购自Sigma公司；FastStart Universal SYBRGreen Master（ROX）购自罗氏公司。

1.3 CEK制备

[11]和[12]方法制备CEK细胞，取16～20胚龄鸡胚，气室朝上，碘酊消毒后酒精棉脱碘，晾干后无菌镊子击破蛋壳取出鸡胚，剖开腹腔分离肾脏，于预热的D-Hank's液中洗涤，剔除血液等杂质，将肾脏转移至新鲜D-Hank's液中，剪成小块，加入适量0.25%胰酶，置于37℃水浴锅中消化至组织疏松透明、呈絮状。离心去除上清，加入1mL含10%胎牛血清的M199培养液悬起沉淀，混匀后用200目铜网过滤，将细胞数调整至约5×105个·m L-1，铺板，37℃含5%CO2培养箱中培养48 h换液，至长成单层，更换为含2%胎牛血清M199维持液。

1.4 IBVM 41株感染CEK细胞

将长成单层的CEK细胞D-Hank's液洗3次，加入IBVM41株病毒悬液，放至37℃含5%CO2培养箱中孵育1 h，弃掉悬液，D-Hank's液洗3次，补充无血清M199培养液，未接种病毒细胞更换为无血清M199培养液继续培养作空白对照。置于37℃培养箱中培养至感染组产生CPE，显微镜下观察并拍照。

作IBV感染CEKs的RT-PCR鉴定。病毒悬液RNA提取按照上海飞捷总RNA极速抽提试剂盒说明书操作，以Oligo dT（18）为反转录引物，按照MLV反转录说明书反转录合成cDNA。以IBV N基因引物（见表1）扩增目的基因。PCR反应条件为95℃预变性5min；94℃变性30 s，55.7℃退火30 s，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸10min。PCR扩增结束后取2μLPCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表1 IBV N基因引物Table1 Primers for am plification of IBV N gene

1.5 M TT法检测MβCD对CEK细胞毒性

将分离CEK细胞接种至96孔细胞培养板，待细胞长至单层后，去除生长液。预冷的D-Hank's液洗细胞3次，加入100μL含不同浓度MβCD（0、2.5、5、7.5、10、15、20mmol·L-1）M199培养液处理细胞，于37℃含5%CO2培养箱中孵育1 h，每个浓度5个重复。加入10μL 5mg·mL-1MTT液，继续培养4 h。吸出孔内液体后，每孔加入150μL DMSO液，室温振摇10min，使结晶物溶解。酶标仪检测各孔OD值（检测波长490 nm）。

1.6 MβCD去除CEK细胞膜胆固醇对病毒感染影响

1.6.1 MβCD膜胆去除CEK细胞膜胆固醇对IBV感染影响

选择24孔板中状态良好、每孔铺满80%CEK细胞的单层细胞，预冷D-Hank's液洗涤3次，设置感染组和对照组，每个浓度3个重复。感染组每孔分别加200μL含有2.5、5、7.5、10mmol·L-1MβCD无血清M199培养液处理细胞，对照组每孔加200μL无MβCD、无血清M199培养液，37℃5% CO2培养箱中培养30min。弃去液体，预冷D-Hank's液洗3次，除去MβCD，然后加入100 TCID50的IBV病毒悬液，37℃培养1 h，弃去病毒液，再用预冷D-Hank's液洗3次，加入M199培养液继续培养24 h，收取样品[13]。

1.6.2 MβCD样去除CEK细胞膜胆固醇对IBV吸附影响

按1.5.1方法使用MβCD处理CEK细胞后，加入100 TCID50病毒悬液，4℃吸附1 h，弃去病毒液，预冷D-Hank's液洗3次，加入M199培养液继续培养24 h，收取样品。

1.6.3 MβCD样去除CEK细胞膜胆固醇对IBV释放影响

感染组和对照组先接种100 TCID50病毒，37℃培养1 h，预冷D-Hank's液洗3次后，再按1.5.1方法使用MβCD处理细胞，37℃5%CO2培养箱中培养30min，按前述方法洗涤培养。待细胞产生明显病变时收取样品。

1.7 细胞膜胆固醇去除再补充对病毒感染影响

用含10mmol·L-1MβCD无血清M199培养液处理细胞后，分别加入含有0、50、100、150、200μmol·L-1胆固醇无血清M199培养液，37℃作用1 h，冷D-Hank's洗3次，加入100 TCID50病毒悬液，培养24 h后收取样品。

1.8 去除病毒囊膜胆固醇

为检测病毒囊膜胆固醇对IBV感染重要性，分别用0～10mmol·L-1MβCD处理10 000 TCID50病毒悬液，37℃孵育30min。生长良好CEK单层细胞用预冷D-Hank's液洗3次，将MβCD处理病毒悬液用M199培养液100倍稀释后加入感染组细胞，37℃培养1 h，对照组接种100 TCID50无处理病毒。最后，感染组和对照组细胞分别用预冷DHank's液洗3次，37℃CO2培养箱中24 h后收取样品。

1.9 Real Time PCR

采用上海飞捷总RNA极速抽提试剂盒分离细胞浆或悬液中总RNA，Oligo dT（18）反转录合成相应cDNA。荧光定量PCR操作按照罗氏FastStart Universal SYBRGreen Master(ROX)两步法操作，IBV上下游引物分别为：IBV-NF：5'CAAGCTAGGTTT AAGCCAGGT 3'，IBV-NR：5'TCTGAAAACCGTAG CGGATAT 3'。β-actin上下游引物为：5'ATTGCTG CGCTCGTTGTT 3'，5'CTTTTGCTCTGGGCTTCA 3'。每组设3个重复，细胞组作阴性对照，水对照作空白对照。

1.10 病毒效价TCID50测定

处理后病毒样品M199培养液作连续10倍系稀释，从10-1～10-8，分别加至铺满单层CEK细胞96孔细胞板中，每个稀释度接种6孔，每孔100μL，对照组细胞加入等量无血清M199培养液。48 h后显微镜下观察记录，按Reed-Muench法计算。

1.11 统计学分析

数据采用SPSS 17.0和Graphpad Prism 6作统计学分析，P＜0.05为具有统计学差异标准。

2 结果与分析

2.1 IBV M 41株感染CEK细胞

IBVM41株感染CEK细胞后，倒置显微镜下观察。接种病毒CEK细胞在感染后24 h出现轻微病变，48 h时CEK细胞变圆、固缩，75%细胞脱落并观察到细胞融合现象，失去原有细胞形态。空白对照无病变（见图1）。

图1 IBV在CEK细胞上细胞病变Fig.1 Cytopathic effects(CPE)of IBV on CEK s

病毒培养物经RT-PCR鉴定，产物大小约为1 750 bp（见图2），与预期结果相同。表明IBVM41毒株可以在CEK细胞增殖。

图2 IBV N基因PCR扩增Fig.2 PCR am plification of IBV N gene

2.2 MβCD对CEK细胞毒性检测

采用MTT检测法确定MβCD对CEK细胞毒性作用。结果显示，随着MβCD浓度增大，细胞产生损伤性变化，OD值降低，而当MβCD浓度≤10 mmol·L-1时，对CEK细胞活性影响较小（见图3）。因此，后续试验中MβCD最高浓度为10mmol·L-1。

图3 MTT检测MβCD对CEK细胞膜毒性Fig.3 Toxicity of MβCD to CEK sdetected by M TT assay

2.3 MβCD去除细胞膜胆固醇对IBV感染CEK细胞影响

2.3.1 MβCD去除细胞膜胆固醇对IBV感染CEK细胞影响

为研究IBV进入CEK细胞是否需要细胞膜胆固醇，向CEK单层细胞中加入含不同浓度MβCD的M199培养液，随后感染IBVM41株病毒。细胞培养24 h后，Real Time PCR和病毒滴定法测定病毒量。结果显示，随着MβCD浓度增大，CEK细胞产生病毒量以剂量依赖性方式减少，10mmol·L-1的MβCD处理后，感染率下降约68%（见图4A），从TCID50结果看，随着MβCD浓度增大，病毒滴度也以剂量依赖性方式降低（见图4B）。

2.3.2 细胞膜去除胆固醇后再补充对病毒感染影响

如图5所示，随着补充外源胆固醇浓度增大，细胞内病毒产量和病毒滴度均呈剂量依赖性恢复。当补充200μmol·L-1胆固醇时，病毒产量恢复至MβCD处理前水平（见图5A）。

2.3.3 MβCD去除细胞膜胆固醇对IBV吸附影响

为进一步确定IBV吸附过程是否受胆固醇影响，去除细胞膜胆固醇后，作病毒吸附试验。如图6所示，随着MβCD浓度增大，病毒产量和病毒滴度均剂量依赖性降低。

图4 去除CEK细胞膜胆固醇对IBV感染力影响Fig.4 Effect of CEK cellularm em brane cholesterol dep letion on IBV infection

图5 细胞膜去除胆固醇后再补充对IBV感染力影响Fig.5 Effectof exogenous cholesterol recovery on IBV in fection after cellularmembrane cholesteroldep letion

图6 去除细胞膜胆固醇对IBV吸附影响Fig.6 E ffect of cellularmem brane cholesterol dep letion on IBV adsorption

2.3.4 MβCD去除细胞膜胆固醇对IBV释放影响

为确定病毒释放过程是否需要细胞膜胆固醇，样品出现CPE后取上清悬液。Real Time PCR和病毒滴定结果均显示，随着MβCD浓度增大，IBV从CEK细胞释放病毒量剂量依赖性降低（见图7）。

2.4 去除病毒囊膜胆固醇对IBV进入CEK细胞影响

为探究IBV病毒囊膜胆固醇是否影响IBV进入CEK细胞，去除病毒囊膜胆固醇后再接种至CEK细胞。去除病毒囊膜胆固醇后，对病毒进入无规律性影响（见图8）。

图7 去除细胞膜胆固醇对IBV释放影响Fig.7 Effectof cellu larmembrane cholesteroldepletion on IBV release

图8 去除病毒膜胆固醇对IBV感染力影响Fig.8 Effectofvirusmembrane cholesteroldep letion on IBV infection

3 讨论与结论

胆固醇为细胞膜重要组分，和鞘磷脂类及一些蛋白共同形成脂筏结构，在病毒感染细胞及释放过程中发挥重要功能。脂筏中胆固醇在多种病毒感染过程中起作用，特别是一些囊膜病毒，如人免疫缺陷病毒（HIV）、脊髓灰质炎病毒（PV）、伪狂犬病毒（PrV）[14]、牛痘病毒、单纯疤疹病毒（HSV）、手足口病毒（HFMD）等[15]。在冠状病毒生命周期中，胆固醇必不可少[16]。与IBV同属冠状病毒的严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）进入细胞时依赖细胞膜胆固醇[17]，猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）感染则同时需要细胞膜和病毒囊膜胆固醇[18]。

Alonso-Caplen等研究表明，IBV Beaudette株可在非洲绿猴肾细胞（Vero）、人肝癌细胞等常见细胞系中复制[19-20]，Holte毒株可在乳仓鼠肾细胞（BHK-21）中复制[21]，Da株可在猴肾细胞（Marc145）等细胞中生长[22]，而几乎所有IBV毒株均可在鸡胚肾细胞（CEK）、鸡胚成纤维细胞（CEF）、肺细胞、肝细胞和鸡肾细胞（CK）中生长[23]，其中以鸡胚肾细胞和鸡肾细胞中生长良好。由于CEK细胞源于IBV易感宿主，相较于其他细胞系更接近IBV感染环境，且对IBV具有极高敏感性，接种后可见明显细胞病变，成为研究IBV感染细胞致病过程及机制适宜宿主细胞模型[11]。本试验中IBV M41株感染CEK细胞出现细胞变圆、固缩、聚集成团等典型CPE，且PCR结果鉴定正确，说明M41可有效感染CEK细胞并产生典型病变。

本研究通过Real Time PCR和病毒滴度试验探究细胞膜和病毒囊膜胆固醇对IBV感染CEK细胞影响。首先确定IBV感染CEK细胞时依赖细胞膜胆固醇，使用MβCD去除细胞膜胆固醇后，病毒感染力显著降低且呈剂量依赖性。为进一步验证去除胆固醇影响，MβCD去除细胞膜胆固醇后，梯度剂量补充外源胆固醇，结果显示IBV病毒繁殖数量恢复，当外源性胆固醇浓度为200μmol·L-1时，感染力恢复至处理前，证实病毒感染力降低由胆固醇缺失引起，且此抑制作用可逆。本研究还发现IBV吸附和释放过程也受CEK细胞膜胆固醇影响。而去除病毒囊膜胆固醇后，病毒感染力和病毒滴度均无规律性变化，故认为IBV感染时无需病毒囊膜胆固醇。综上，IBV感染CEK细胞过程，为细胞膜胆固醇而非病毒囊膜胆固醇发挥功能，对阐明IBV感染宿主细胞相互作用过程及致病机制具有重要意义。

[参考文献]

[1]Liu X L,Su JL,Zhao JX,etal.Complete genome sequence anal⁃ysis of a predominant infectious bronchitis virus(IBV)strain in China[J].VirusGenes,2009,38(1):56-65.

[2]李广兴,王新,潘龙,等.IBV HH06株N基因原核表达及间接ELISA方法的建立[J].东北农业大学学报,2014,45(5):75-82.

[3]贺会利,魏小兵,欧长波,等.鸡传染性支气管炎病毒研究进展[J].动物医学进展,2014,35(7):73-77.

[4]Pratelli A,Colao V.Role of the lipid rafts in the life cycle of ca⁃ nine coronavirus[J].Journal of General Virology,2015,96:331-337.

[5]李咏梅,王雪松,孙秀敏.甲基-β-环湖精对人类疱疹病毒6型感染性的影响[J].北华大学学报:自然科学版,2007,8(2):113-117.

[6]Carro A C,Damonte EB.Requirementof cholesterol in the viral envelope for dengue virus infection[J].Virus Research,2013,174 (1-2):78-87.

[7]Zhu Y Z,Wu D G,Ren H,etal.The role of lipid rafts in the early stage of Enterovirus 71 infection[J].Cellular Physiology&Bio⁃chemistry,2015,35(4):1347-1359.

[8]Jin C,Fu X,Xie J,etal.Critical role of cellular cholesterol in bo⁃vine rotavirusinfection[J].Viology Journal,2014,11(1):1-7.

[9]Imhoff H,Von M V,HerrlerG,etal.Canine Distemper Virus in⁃fection requires cholesterol in the viral envelope[J].Journal of vi⁃rology,2007,81(8):4158-4165.

[10]Martín J J,Holguera J,Sánchez-Felipe L,et al.Cholesterol de⁃pendence of newcastle disease virus entry[J].Biochimica Et Bio⁃physica Acta,2012,1818(3):753-761.

[11]李华伟,武聚富,庄英华,等.鸡传染性支气管炎病毒M41型的扩繁及在鸡胚肾细胞上的适应性研究[J].北京农学院学报, 2011,26(3):31-34.

[12]王和平.IBV在CEK细胞传代过程中S1基因变化的研究[D].哈尔滨:东北农业大学,2007.

[13]孙颖,肖少波,王荡,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒侵入和释放依赖细胞膜胆固醇[J].中国科学:生命科学,2011,41(11): 1079-1085.

[14]Desplanques A S,Nauwynck H J,Vercauteren D,et al.Plasma membrane cholesterol is required for efficient pseudorabies virus entry[J].Virology,2008,376(2):339-345.

[15]Sun Y,Xiao S,Wang D,et al.Cellularmembrane cholesterol is required for porcine reproductive and respiratory syndrome virus entry and release in MARC-145 cells[J].Science China Life Sciences,2011,54(11):1011-1018.

[16]Pratelli A,Colao V.Rloe of the lipid rafts in the cycle of canine coronavirus[J].JournalofGeneral Viology,2015,96(2):331-337. [17]LiG M,Li Y G,Yamate M,et al.Lipid rafts play an important role in the early stage of severe acute respiratory syndrome-coro⁃navirus life cycle[J].Microbes&Infection,2007,9(1):96-102.

[18]Ren X,Glende J,Yin J,etal.Importance of cholesterol for infec⁃tion of cells by transmis-Bible gastroenteritis virus[J].Virus Re⁃search,2008,137(2):220-224.

[19]Alonso-Caplen FV,Matsuoka Y,Wilcox GE,etal.Replication andmorphogenesis of avian coronavirus in vero cells and their in⁃hibition bymonensin[J].Virus Research,1984,1(2):153-67.

[20]Tay F P,Huang M,Wang L,et al.Characterization of cellular furin contentasa potential factor determining the susceptibility of cultured human and animal cells to coronavirus infectious bron⁃chitis virusinfection[J].Virology,2012,433(2):421-30.

[21]OtsukiK,Noro K,Yamamoto H,etal.Studieson Avian Infectious Bronchitis Virus(IBV)II.Propagation of IBV in Several Cultured Cells[J].Archivesof Virology,1979,60(2):115-122.

[22]姚四新，李永清，杨国友，等.鸡肾型传染性支气管炎病毒适应于Marc 145细胞的观察[J].中国兽医杂志,2002,38(4):9-10.

[23]Coria M F.Intracellular avian infectious bronchitis virus:detec⁃tion by fluorescent antibody techniques in nonavian kidney cell cultures[J].Avian Diseases,1969,13(3):540-547.

Effect of cholesterol on infectious bronchitis virus infection of CEKs/LI

Guangxing1,ZHAO Lei1,CHEN Huijie1,LANG Yueshen2,LIU Peng1,HUANG Xiaodan1,WANG Hongwei1,REN Yudong3,ZHANG Ruili1
(1.Key Labo ratory fo r Labo rato ry Anim a ls and Com pa rative Med icine o f Heilongjiang Province,Schoo lo f Ve te rina ryMed icine,No rtheast Agricu ltu ra l University, Ha rbin 150030,China;2.Qinglong Manchu Autonom ous County Voca tiona l Education Cen ter, Qinhuangdao Hebei066500,China;3.School o f Electrica l and In form ation,No rtheast Ag ricu ltu ra l University,Harbin 150030,China)

Cholesterol is an important component to maintain the stable structure of lipid rafts on cellular membrane.For som e enveloped viruses,the infection of host cell depends on the participation of cholesterol.In this paper,pretreatment of chicken em bryo kidney cells(CEKs)w ith methyl-β-cyclodextrin (MβCD),a drug used to dep lete cholesterol from membranous structure,to analyze whether the cellular or viralmembrane cholesterol played a role in chicken infectious bronchitis virus(IBV)infection of CEKs.The results showed thatsignificantly decrease of IBV infection in a dose-dependentmanner through real time RTPCR and virus titer test,and IBV infection could be partially restored by supplementing exogenous cholesterol,indicated that IBV infection depended on cellular membrane cholesterol.Further studies discovered that the rem oval of cellular membrane cholesterol affected IBV attachment and release stage.李广兴,赵蕾,陈慧杰,等.胆固醇对鸡传染性支气管炎病毒感染鸡胚肾细胞的影响[J].东北农业大学学报,2017,48(4):45-52. LiGuangxing,Zhao Lei,Chen Huijie,etal.Effectof cholestero lon in fectious bronchitis virus infection ofCEKs[J].Journalof NortheastAgricultura lUniversity,2017,48(4):45-52.(in Chinese w ith English abstract)However,the removal of viral envelope cholesterol had no effect on IBV infection.These results demonstrated that IBV infection of CEKs was dependent on cellular membrane and no viral envelope cholesterol.

Cholestero l;ce llularmembrane;infectious bronchitis virus;chicken embryo kidney ce lls; infection

S831.7

A

1005-9369（2017）04-0045-08

时间2017-4-24 6:19:54[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170424.0619.010.html

2017-03-02

国家自然科学基金项目（31172295，31272569）

李广兴（1968-），教授，博士生导师，研究方向为动物病理学。E-mail:liguangxing1968@hotmail.com