牛粪沼液对枯草芽孢杆菌产孢影响

李文哲，王金秋，范金霞，殷丽丽，马依文，李泽

（东北农业大学工程学院，哈尔滨150030）

牛粪沼液对枯草芽孢杆菌产孢影响

李文哲，王金秋，范金霞，殷丽丽，马依文，李泽

（东北农业大学工程学院，哈尔滨150030）

枯草芽孢杆菌是生产微生物菌肥的有效微生物菌种之一，芽孢含量直接影响菌肥效果。为降低生产成本，提高发酵液中芽孢数量，探究牛粪沼液对枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）D1产孢影响。采用分批培养法确定发酵培养基中沼液最适浓度及碳源与氮源种类和含量。利用比浊法和稀释平板涂布法检测枯草芽孢杆菌的菌体数量及芽孢产率，采用火焰原子吸收光谱法检测沼液中金属离子含量。结果表明，牛粪沼液中含有对产孢有显著影响的Ca2+、Mn2+、Mg2+三种离子；当沼液与水配比为1∶1时，产孢效果最佳；麸皮和大豆粉分别是菌株生孢最佳碳源、氮源；最适碳源和氮源含量分别为2.0%和0.5%（质量比），35℃，120 r·m in-1恒温培养24 h后，产芽孢率可达83.77%。

枯草芽孢杆菌；沼液；芽孢产率；菌体数量；培养基

李文哲,王金秋,范金霞,等.牛粪沼液对枯草芽孢杆菌产孢影响[J].东北农业大学学报,2017,48(4):53-60.

Li W enzhe,Wang Jinqiu,Fan Jinxia,et al.Effect of biogas slurry of cow dung on spore production for Bacillus subtilis[J]. Journalo f NortheastAgricultu ra lUniversity,2017,48(4):53-60.(in Chinese w ith English abstrac t)

枯草芽抱杆菌是严格好氧革兰氏阳性菌，生命力强，代谢旺盛[1]。该菌种产品达800多种[2]。美国4株枯草芽孢杆菌（GBO3，MB1600，QST713和FZB24）获得环保局（EPA）商品化或有限商品化生产应用许可，GBO3和MB1600分别由美国Gus⁃tafson和Microbis Ltd公司开发，根部施用或拌种可防治Fusarium，Aspergillus，Alternaria和Rhizocto⁃nia引起的豆类、麦类、棉花和花生根部病害[3-4]。我国枯草芽孢杆菌研究和应用广泛。现已开发并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁等[5]。影响制剂应用效果关键因素是制剂中芽孢含量[6]。枯草芽孢杆菌制成制剂过程需大量芽孢，工业化生产中芽孢产率较低[7]，提高芽孢产率要求发酵培养基含适量碳源、氮源、多种中微量元素并具备最适发酵工艺条件。目前培养基中微量元素主要通过添加MgSO4、MnSO4、CaCO3、Nacl等分析纯，生产成本高，限制其工业化应用，也是研究热点及难点。张丽霞等证实，枯草芽孢杆菌发酵最佳培养基组成是玉米粉10 g，葡萄糖5 g，豆饼粉15 g，鱼粉5 g，CaCO35 g，（NH4）2SO41 g，K2HPO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·H2O 0.2 g，水1 000mL，产芽孢率达79%[8]。王剑等优化后发酵培养基配方为玉米粉24.24 g·L-1，KNO36.99 g·L-1，黄豆粉26.09 g·L-1，MgSO45.00 g·L-1，MnSO418mg·L-1。多种分析纯试剂提供培养基中微量元素，成本高，难以生产推广[9]。

沼液是沼气工程发酵残留物，应用方式粗放，污染环境，但沼液中含丰富有机质、氮、磷、钾等微量元素及氨基酸、活性酶。这些元素大部分以速效养分形式存在，为微生物提供生长必需养分[10]。前期试验发现，沼液中枯草芽孢杆菌生长繁殖能力较强，本研究利用前期获得枯草芽孢杆菌为试验菌株，沼液作培养基稀释液，探究最适沼液浓度，确定最适添加量碳源和氮源种类。获得高产芽孢培养基，为其工业化高效稳定生产提供技术支持，降低工业成本，为沼液高附加值应用提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种：本试验选用枯草芽孢杆菌Bacillussubti⁃lis D1由东北农业大学能源与动力实验室分离、纯化并保存。

材料：玉米粉、麸皮、豆粕粉均购自哈尔滨市香坊区农贸市场；麦芽糖，可溶性淀粉，葡萄糖，蔗糖、蛋白胨、玉米粉、NH4Cl、（NH4）2SO4、NaNO3、NH4NO3均为分析纯试剂；沼液来自牛粪厌氧发酵，成份为全氮1 580、全磷379、全钾998mg·kg-1，pH 7.52，TS5%。

菌种活化培养基：LB液体培养基[11]：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL，5mol·L-1NaOH调节pH 7.0（若用固体培养基加琼脂15 g），121℃，30min高压灭菌。

基本培养基：NaCl 0.5 g，K2HPO43 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 0.015 g，MnSO4·H2O 0.04 g，CaCO30.02 g，蒸馏水1 000mL,121℃，30min高压灭菌。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化

芽孢杆菌D1生长曲线测定：了解生长曲线特征，确定繁殖代时。从4℃保存的枯草芽孢杆菌D1斜面中挑取一环置于无菌水中，摇匀制成菌悬液，取1mL接种于装有100mL LB培养基的250 mL三角瓶中，至于摇床上培养，温度为30℃、转速为100 r·min-1，分别于震荡培养0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和24 h后取样，用无菌水稀释，利用比浊法测定OD600值，确定其生长高峰期时间。

种子培养液：用接种环从单菌落平皿中挑一颗稀释于无菌水中摇匀，再用移液枪吸取，以1%（体积比）的量接种于含有LB培养基三角瓶中。摇床培养，温度设为30℃、转速为100 r·min-1，培养在20 h（生长曲线菌数生长最大时间）后即可获得种子培养液。

1.2.2 产孢培养基成分优化

最佳碳源筛选：选择麦芽糖，可溶性淀粉，葡萄糖，蔗糖，玉米粉，麸皮作为碳源按10 g·L-1加入含蛋白胨（5 g·L-1）基本培养基中，121℃，30 min高压灭菌。将活化后菌液以1%（体积比）接种量分别接种，150mL三角瓶装液量30mL，摇床培养，温度30℃、转速200 r·min-1下培养24 h后，无菌水梯度稀释，选择合适浓度分别测定细菌总数和芽孢数并记录，确定最佳碳源。

最佳氮源筛选：选择蛋白胨、大豆粉、玉米粉、NH4Cl、（NH4）2SO4、NaNO3、NH4NO3作为产孢培养基氮源，按5 g·L-1加入含碳源筛选试验确定最佳碳源（10 g·L-1）的基本培养基中，150mL三角瓶装液量30mL，121℃，30min高压灭菌，培养基中最佳氮源确定，接种、培养和测定方法同上。

最适碳源浓度确定：将碳源筛选试验确定的最佳碳源按质量分数为0.5%、1%、1.5%、2.0%、2.5%加入5 g·L-1氮源筛选试验确定的最佳氮源基本培养基中，150mL三角瓶装液量30mL，121℃，30min高压灭菌，不同碳源含量影响试验，接种、培养和测定方法同上。

最适氮源浓度确定：将氮源筛选试验确定的最佳氮源按质量分数为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%加入含10 g·L-1碳源筛选试验确定的最佳碳源基本培养基中，150 mL三角瓶装液量30 mL，121℃，30min高压灭菌。不同氮源含量影响试验，接种、培养和测定方法同上；

最适沼液浓度确定：移液枪分别量取0.3mL已活化菌液，接种到分别含30、21、15、9和0mL沼液的150mL三角瓶中，三角瓶装液量为30mL，剩余三角瓶装液量用蒸馏水补充，制成沼液不同浓度稀释液。121℃，30min高压灭菌。摇床培养，温度30℃、转速200 r·min-1下培养24 h后，利用无菌水梯度稀释，选择合适浓度分别测定记录细菌总数和芽孢数，确定最佳沼液浓度。

沼液中金属离子确定：沼液经沉淀、吸附脱色、20 000 r·min-1离心和0.22μm滤膜过滤后测定沼液中Mn2+、Ca2+、Mg2+三种离子含量。

1.2.3 试验指标测定及数据处理

沼液中Mn2+、Ca2+、Mg2+三种离子含量测定采用火焰原子吸收法[12]。

细菌总数检测采用分光光度法（600 nm）。

芽孢数量测定：80℃水浴加热15min，冷却后利用稀释倒平板法检测芽孢生成量[13]，重复3次，取平均值。

利用Excel等软件分析处理数据。

2 结果与分析

2.1 生长曲线测定

采用比浊法测定，由于细菌悬液浓度与光密度（OD值）成正比，可利用分光光度计测定菌悬液光密度推知菌液浓度，并将所测OD600值与其对应培养时间制图，绘出该菌在一定条件下生长曲线，见图1。

图1 枯草芽孢杆菌D1菌种生长曲线Fig.1 Cu rve for grow th of D 1 cell

由图1可知，0～6 h为生长延缓期，由于单菌落菌较少且从固体培养基转移至液体培养基环境变化较大，出现6 h延缓期，此时细菌数量极少；延缓期后该菌生长良好，6～16 h进入对数生长期，菌体数量急剧增多；16～22 h菌体增速缓慢，为枯草芽孢杆菌生长稳定期，细胞内开始积累贮藏物，如肝糖颗粒，异然颗粒，脂肪颗粒等，细菌形成芽孢，细胞次级代谢产物大量积累，菌细胞总数也达最高峰，16～22 h时菌液作为菌种较适宜，20 h达生长高峰期。芽孢杆菌D1衰亡期不明显，推测后期形成芽孢对环境具有较强抗逆性。因此，根据生长特点选择20 h培养液作为菌种后续处理，既保持较高细胞活力，又可获得较多细胞。

2.2 培养基成分优化

2.2.1 最佳碳源确定

碳源是组成培养基主要成分之一，供给菌种生命活动所需能量，构成菌体细胞成分和代谢产物中碳素来源[14]。一般微生物可在含各种碳水化合物培养基上生长良好，但产物生产能力与碳源种类有关，碳源种类及浓度主要由菌种耐渗透压和调节细胞膜渗透性决定[15]，在培养基其他成分不变情况下，试验分别以玉米粉、麸皮、可溶性淀粉作为发酵培养基中唯一有机碳源，以葡萄糖、麦芽糖、蔗糖分别作为发酵培养基唯一无机碳源，其他组分均相同发酵培养，结果见图2。

图2 不同碳源对芽孢产率及OD值（细菌数量）影响Fig.2 Effect of different carbon resou rceson the biomass and spore production rate of D 1 cell

由图2可知，枯草芽孢杆菌D1对试验碳源均可利用，其中可溶性淀粉、麦芽糖和麸皮为碳源时OD值分别为：0.673、0.576、0.556，总菌数较多；可溶性淀粉和麸皮为碳源时枯草芽孢杆菌D1生长明显优于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，说明枯草芽孢杆菌D1利用有机碳源能力优于单糖和二糖；以麸皮为碳源时芽孢产率最高为67.35%，可溶性淀粉产孢率为65.64%，二者产孢效果相差甚小。但考虑工业生产成本，麸皮价格低廉且易获得，无机碳源中，麦芽糖为碳源时产孢效果较好，产孢率为64.31%，其次为蔗糖。所测细菌数量及芽孢产率数据方差统计分析，P＜0.05，各种碳源添加对产生芽孢影响显著。综上，麸皮为最佳碳源。

2.2.2 最佳氮源确定

氮源主要是微生物细胞物质和含氮代谢物氮素来源。氮源作为枯草芽孢杆菌发酵培养基另一主要因素，在芽孢形成中也发挥重要作用[16]。将培养基中碳源固定为最佳碳源麸皮，分别添加蛋白胨、豆粕粉、玉米粉3种有机氮源和NH4Cl、（NH4）2SO4、NaNO3、NH4NO34种无机氮源，其他成分不变，测定SO42+离子对菌株细菌数量及芽孢产率影响；单独NH4+离子、NO3-离子及二者组合后对菌株细菌数量及芽孢产率影响，结果见图3。

由图3可知，枯草芽孢杆菌可利用这7种氮源，且单独NO3-离子对枯草芽孢杆菌D1总菌数比单独NH4+离子和二者组合后NH4NO3影响大，OD值分别为0.284、0.234、0.258；对芽孢产率影响上，二者组合后NH4NO3效果优于NH4+离子和NO3-离子单独使用。有机氮源蛋白胨和大豆粉作为氮源时枯草芽孢杆菌D1生长明显优于无机氮源，这主要与有机氮源中除含丰富蛋白质、肽类、游离氨基酸以外，还含少量糖类、脂肪和生长因子等有关。其中蛋白胨作为氮源时对细菌总数影响最大，OD值最大，为0.435，其次是大豆粉和Na⁃NO3，二者OD值分别为0.389和0.384，对细菌总数影响相差较小，玉米粉对菌体生长影响最小，OD值仅为0.101，可能由于玉米粉中醇溶蛋白含量过高抑制其生长；蛋白胨作为碳源时对菌种芽孢生成促进作用最大，芽孢产率为74.64%，其次是大豆粉，为69.23%，再次是NaNO3，为61.02%，对菌种产孢影响最小的是玉米粉，产孢率仅44.59%。有机氮源中，相比大豆粉，蛋白胨价格昂贵，大规模生产使用时成本较高；而无机氮源NaNO3较大豆粉成分单一，且大豆粉作为有机氮源除提供氮源外还可提供无机盐，取材方便，价格较低，故枯草芽孢杆菌D1培养基最佳氮源应选大豆粉。

所测细菌数量及芽孢产率数据经方差统计分析，P＜0.05，显示各氮源添加对枯草芽孢杆菌D1芽孢影响显著。

图3 不同氮源对芽孢产率及OD值（细菌数量）影响Fig.3 Effect of d ifferent nitrogen resourceson the biom ass and spore p roduction rate of D 1 cell

2.2.3 最佳氮源浓度确定

由图4可知，将培养基中碳源固定为1.0%最优碳源麸皮，其他成分不变，不同质量分数（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）最优氮源对枯草芽孢杆菌D1细菌数量及芽孢产率影响不同。

当大豆粉质量分数为0.5%时，菌体达到最大生长量，OD值为0.669，菌种生长量为大豆粉0.5%＞0.7%＞0.9%＞0.3%＞0.1%，大豆粉0.1%与0.3%时，菌体生长量接近。随着大豆粉浓度提高，菌体长势良好并达最大值，随着浓度继续增加，培养基渗透压增大，菌种生长量随之下降；芽孢产率在大豆粉质量分数为0.5%时最高，为72.64%，随着浓度增加，营养成分过多抑制芽孢产生，芽孢产率逐渐降低，在大豆粉质量分数为0.9%时，仅为59%。因此，0.5%为最适大豆粉浓度。经细菌数量及芽孢产率数据方差统计分析，P＜0.05，表明添加不同浓度氮源对产生枯草芽孢杆菌D1芽孢影响显著。

图4 不同氮源浓度对芽孢产率及OD值（细菌数量）影响Fig.4 Effectof differentnitrogen source concentration on thebiomass and spore production rateof D1 cell

2.2.4 最佳碳源浓度确定

将培养基中大豆粉固定为0.5%，分别加入质量分数0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%最优碳源麸皮，其他成分不变，接种培养。结果显示不同浓度麸皮对枯草芽孢杆菌D1细胞数量及芽孢产率量影响不同，且差异显著。

由图5可知，随麸皮浓度不断增加，枯草芽孢杆菌D1细菌数量增加，浓度为2.0%时菌种数量最多，此时OD值为0.663，然后下降，在麸皮浓度为2.5%时，OD值为0.604，菌种数量的影响相差较小，选择低浓度麸皮可降低生成成本；当麸皮质量分数为2.0%时，芽孢产率达最大，为78.74%，对芽孢产率影响排序为麸皮2.0%＞1.5%＞1.0%＞2.5%＞0.5%。

经细菌数量及芽孢产率数据方差统计分析，P＜0.05，说明不同浓度麸皮添加对枯草芽孢杆菌D1芽孢影响显著。综上，培养基中最适麸皮浓度为2.0%。

2.3 沼液对产孢影响

2.3.1 沼液最适浓度确定

沼液中含较丰富营养物质，前期试验发现枯草芽孢杆菌D1在沼液中生长良好，但细菌总数和芽孢产率较低。培养基按一定比例配制的多种营养物质混合液[39]，培养液浓度对菌体生长影响较大。

将150mL三角瓶中大豆粉固定为0.5%，麸皮固定为2.0%，沼液沉淀、过滤和离心处理后，利用蒸馏水稀释成不同浓度（100%、70%、50%、30%、0）稀释液分别加入三角瓶中验证沼液对D1总菌数和芽孢产率影响，结果见图6。

图6 不同的沼液浓度对芽孢产率及OD值（细菌数量）影响Fig.6 Effectof different cow dung biogasslurry concentration on thebiomass and spore production rateof D1 cell

由图6可知，在沼液浓度为70%时，菌体生长量最大，OD值为0.617，在沼液浓度50%和30%时，菌体生长量相差最小，OD值较接近，分别为0.599和0.562。沼液浓度为0时菌体生长量低于浓度100%时菌体生长量，此时沼液浓度为0的三角瓶中供菌体生长营养成分较少，仅靠麸皮和大豆粉供生长能量，菌体生长量小；随着沼液浓度降低，此时枯草芽孢杆菌D1产孢趋势较好，菌种芽孢产率增大，在沼液浓度为50%时最大，为83.77%，由于沼液浓度过大时，促进芽孢产生营养成分过多，抑制芽孢形成。沼液浓度继续降低，芽孢产率呈下降趋势，沼液浓度为0时产孢率最低，为30%，此时培养液浓度过低，营养成分无法供菌体产孢。沼液作为产孢培养基时，其浓度对D1菌种数量和芽孢产率均有较大影响，综合考虑，当沼液与水比值为1：1，即沼液浓度为50%时，配合麸皮和大豆粉后使产孢率达83.77%，高于前文中加入麸皮和大豆粉基础培养基中芽孢产率78.74%。

所测细菌数量及芽孢产率数据经方差统计分析，P＜0.05，说明各种配比对芽孢影响显著。

2.3.2 金属离子对产孢影响

利用稀释后沼液配合2.0%麸皮和0.5%大豆粉作为培养基培养菌种时，未额外添加金属离子，与基础产孢培养基成分对比，沼液中含一定量Ca2+、Mn2+、Mg2+对产孢有促进作用，检测结果为Ca2+14.8、Mg2+0.151、Mn2+0.08 ppm。其中，Ca2+离子含量最高，Mn2+离子含量最低。金属离子含量影响菌体生长代谢，培养基中加入100%沼液效果不佳。

3 讨论

农业土壤板结、微生物区系变化等造成经济损失和环境污染等问题。微生物肥料取代化肥研究备受关注，生物菌肥是一种新型肥料和多元素肥料，主要由固氮菌、解钾菌及多种微量元素和腐殖酸组成。生物菌肥主要以微生物生命活动产物活化土壤，改善作物营养条件和生长环境，具有改善土壤活性、抵抗干旱及防治病虫害，提高土壤活性作用[17]。

枯草芽孢杆菌作为有益根际微生物[18]，目前在净化水产养殖环境、农作物病害防治、家禽饲料添加剂等方面取得较好效果，本身无致病性，极端条件下产生抗逆性较强内源孢子，枯草芽孢杆菌易于生产，便于加工，菌剂加工时易存活、定殖与繁殖[18]。因其制剂稳定、储存期长，是理想生防微生物。芽孢是产芽孢细菌在生长过程中形成抗逆性休眠体，受营养物质和环境因素影响[19]。金属离子对芽孢产率影响显著，章四平等认为Ca2+、Mn2+、Mg2+促进菌株生长，菌株生长量显著增加，最佳金属离子为Ca2+[20]。Ca2+离子可促进芽孢形成并参与调节细胞的生理状态。大多数Ca2+离子与芽孢特有化学成分吡啶二羧酸结合，形成钙-吡啶二羧酸复合物约占芽孢干重10%，复合物通过降低芽孢含水量增加芽孢抗逆性[21]。郭夏丽等认为Mn2+离子对芽孢生成有显著影响[22]。Mn2+离子是超氧化物歧化酶、黄嘌呤氧化酶、L-阿拉伯糖异构酶等辅助因子，是微生物生长和芽孢形成所需微量元素[23]。姚露燕等发现，金属离子影响枯草芽孢杆菌发酵生产芽孢产率，其中Mg2+离子影响最显著，其次为Mn2+，Ca2+和Fe2+离子[24]。Mg2+是细胞中某些酶的活性基团，具有调节和控制细胞质胶体状态、细胞质膜通透性和细胞代谢活动功能[25]。

沼液是以养殖场废弃物为主的沼气发酵后产物，其中含一定量Ca2+、Mn2+、Mg2+离子，配合外加碳源和氮源，可降低枯草芽孢杆菌发酵成本，提高综合利用价值。但孙梅等认为Mg2+离子有利于活菌生长而非芽孢生成[26]；宋卡魏等认为Mn2+离子对活菌生长和芽孢生成均有促进作用，但当含量达到某一域值时，呈抑制趋势[27]。沼液中除含有微量元素外，还含有水解酶、B族维生素及多种氨基酸、吲哚乙酸、赤霉素等活性物质[28]，可能对D1总菌数及芽孢产率起促进作用，待进一步验证。

C/N直接影响菌体生长和代谢，碳源转化为微生物细胞物质和代谢产物，是能源物质[29]。氮源是构成微生物细胞蛋白质和核酸主要元素，而蛋白质和核酸是微生物原生质主要组成部分[30]。C/N偏低，菌体生长过剩，易造成菌体提前衰老自溶；C/N过高，菌体繁殖数少，发酵密度低，细菌代谢不平衡，不利于产物积累；C/N合适但C、N源浓度过低，影响菌体繁殖，C、N浓度过高，则发酵起始导致菌体大量繁殖，代谢废物过多而增加发酵液黏度，使溶解氧降低，引起菌体代谢异常，最终影响产物合成[31]。碳源和氮源是微生物细胞和代谢产物重要营养物质，也是发酵培养基重要组成部分[32]。

本研究确定最佳碳源和氮源分别为麸皮和大豆粉。大豆粉中蛋白质含量高，不饱和脂肪酸含量较高，麸皮中含较多蛋白质，其作营养原料培养菌株时，除有足够碳水化合物外，还需适量氮元素和其他微量元素，与沼液中Ca2+、Mn2+、Mg2+三种离子配合使用，以增加培养基产孢能力，减少无机分析纯原料使用，提高芽孢产率，降低成本。

4 结论

本试验通过摇瓶试验验证沼液对枯草芽孢杆菌D1总菌数及芽孢产率影响，发现沼液中含有促进其生长的Ca2+、Mn2+、Mg2+离子，在沼液和水配比为1：1时枯草芽孢杆菌D1产芽孢率最大；确定最适碳氮源分别为：质量分数2.0%麸皮和0.5%大豆粉。优化后枯草芽孢杆菌D1芽孢产率显著提高，可达83.77%。本研究利用前期筛选获得枯草芽孢杆菌D1菌株，采用稀释沼液作为产孢培养基，充分利用沼液，降低发酵成本，减少化学试剂使用，可为生物菌肥利用提供技术依据。

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Effect of biogas slurry of cow dung on spore production for Bacillus

subtilis/LI Wenzhe,WANG Jinqiu,FAN Jinxia,YIN Lili,MA Yiwen,LI Ze
(School of Engineering, NortheastAgriculturalUniversity,Harbin 150030,China)

Bacillus subtilis is one of the effective m icroorganism strains producing bacterial m anure,and the spore content is one of the im portant factors directly affect the effect of bacterial m anure.In order to im prove the spore num ber in the ferm ented liquid,and reduce the production cost, the influence of biogas slu rry of cow dung on spore production of Bacillus subtilis D1 was investigated. The optim al concentration of biogas slurry and the types and contents of the carbon source and nitrogen source in the fermentation medium were determ ined using batch cu ltivation m ethod.The num ber of bacteria and the rate of spore production were detected w ith turbidim etric method and the dilution p late coating method,respectively.And the contents of metal ions in the biogas slurry were determ ined by the flame atom ic absorption spectrometry.The results showed that the biogas slurry of cow dung contained three kinds of ions Ca2+,Mn2+,and Mg2+,which had the significant effects on the sporu lation.The rate o f spore p roduction w ere the bestwhen the ratio o f biogas slurry to the water w as1:1.The op tima l carbon and nitrogen sources w ere bran and soybean m ea l,respective ly.The op tima l concentration o f carbon source and nitrogen source were 2.0%and 0.5.The highest rate o f spore production was 83.77%in optim almedium at120 r·m in-1and 35℃after 24 h incubation.

Bacillus subtilis;biogas slurry;rate o fspore p roduction;bacterialnumber;medium

S216.4

A

1005-9369（2017）04-0053-08

时间2017-4-24 6:20:04[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170424.0620.014.html

2017-02-24

国家科技支撑计划子课题（2015BAD21B03-02）

李文哲（1955-），男，教授，博士，博士生导师，研究方向为生物质能源生产与利用技术。E-mail:liwenzhe9@163.com