取代基团对含噻二唑片段截短侧耳素衍生物抑制鸡毒支原体活性的影响

方 茜， 王文湘， 高美龄， 阳 涛， 刘雅红， 汤有志

(广东省兽药研制与安全评价重点实验室/华南农业大学 兽医学院，广东 广州 510642)

取代基团对含噻二唑片段截短侧耳素衍生物抑制鸡毒支原体活性的影响

方 茜， 王文湘， 高美龄， 阳 涛， 刘雅红， 汤有志

(广东省兽药研制与安全评价重点实验室/华南农业大学 兽医学院，广东 广州 510642)

【目的】为研发抗鸡毒支原体感染的药物提供试验依据。【方法】合成18种C14支链含噻二唑片段的截短侧耳素衍生物，采用高分辨质谱进行结构确证，通过体外药敏试验研究所合成苯环取代基衍生物对鸡毒支原体抑菌活性的影响。【结果】化合物12、15和17对鸡毒支原体S6的最小抑菌质量浓度(Minimum inhibitory concentration，MIC)均为0.125 0 μg·mL-1，化合物18和对照泰妙菌素对鸡毒支原体S6的MIC值最高，均为0.015 6 μg·mL-1，化合物18氨基被苯甲酰基化后所得化合物17的抗菌活性减弱。【结论】化合物18可作为候选化合物进行深入研究，以开发新的抗支原体感染药物。

鸡毒支原体； 截短侧耳素衍生物； 噻二唑； 高分辨质谱; 最小抑菌质量浓度

感染鸡毒支原体Mycoplasmagallisepticam而引起的慢性呼吸道病是危害禽类的常见疾病，严重影响着养禽业的健康发展[1]，据不完全统计，鸡毒支原体感染鸡群后，会导致雏鸡弱雏率增加10%左右，蛋鸡产蛋率下降10%～20%，肉鸡体质量减少38%，饲料转化率降低21%，胴体质量亦随之下降，该病已成为严重威胁养禽业的疾病之一[2]，而使用抗菌药物是防治鸡毒支原体病的一种重要手段[3]。由于鸡毒支原体没有细胞壁，所以对青霉素类、头孢类等抗菌药不敏感，较为有效的抗菌药有氟喹诺酮类、泰乐菌素、红霉素、庆大霉素、强力霉素、泰妙菌素、沃尼妙林等[4]。其中泰妙菌素等截短侧耳素类衍生物具有独特的抗菌机理，不仅对鸡毒支原体有很好的抑菌效果，而且不易产生耐药性，已经被广泛应用于临床鸡毒支原体病的防治。

截短侧耳素是由 Kavanagh[5]于1951年从高等真担子菌高侧耳属Pleurotusmutilus和P.passeckerinaus菌种培养分离得到的一种三环二萜类化合物，其主体结构由五元、六元和八元环骈合而成。因其独特的抑菌机制，药学工作者设计合成了大量新型截短侧耳素衍生物用于抗菌药物开发[6]。截短侧耳素的结构修饰主要集中在C14位侧链上[7]，C14位侧链如果连接中性基团或酸性基团的化合物，则抗菌活性极低，连接2个碱性中心侧链的衍生物其活性也较低，而连接1个碱性中心的硫醚基侧链，其衍生物抗菌活性往往较好[8-9]。基于噻唑环能增加多数抗菌药物的活性，Ling等[10]设计合成了侧链上含有噻唑环的截短侧耳素类衍生物，经生物活性分析发现，其对临床分离的MRSA(Methicillin-resistantStphylococcusaureus)和耐甲氧西林表皮葡萄球菌均有良好的体外抑菌效果。Wang等[11]在截短侧耳素C14侧链上引入2-氨基噻唑得到系列衍生物，对一些革兰氏阳性耐药菌的抗菌活性强于阿莫西林和泰妙菌素。Shang等[12]在C14位侧链引入噻二唑杂环作为连接基团，合成了大量截短侧耳素衍生物，经体外抑菌活性研究，发现其中具有氨基或叔胺基的化合物对MRSA、无乳链球菌具有较好的抗菌活性。但对抑制截短侧耳素衍生物支原体活性的研究并不多见。

基于以上关于截短的工作侧耳素衍生物的合成及活性研究，结合前人的研究成果[12-13]，本研究设计合成了C14支链引入噻二唑片段的18种截短侧耳素衍生物，以高分辨质谱对所合成化合物进行结构确证，以鸡毒支原体为研究对象，通过体外药敏试验研究了所合成衍生物取代基团对抑菌活性的影响，以期为新型高效截短侧耳素类动物专用抗支原体感染类药物的研发提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

试验材料：截短侧耳素原料、对甲基本磺酰氯、取代苯甲酰氯、2-氨基-5-巯基-1,3,4-噻二唑、吡啶、乙腈、异丙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、硅胶板、无菌EP管、无菌猪血清、L-半胱氨酸、辅酶I、NaOH溶液、鸡毒支原体菌株S6；仪器：磁力搅拌器、旋转蒸发仪、紫外灯、循环泵、无菌超净工作台、二氧化碳恒温培养箱、高压灭菌器、LTQ-Orbitrap高分辨质谱仪(赛默飞世尔科技公司，美国)。

1.2 截短侧耳素衍生物的合成

18种截短侧耳素衍生物的合成在Shang等[13]、王波等[14]合成方法基础上略作改进，具体步骤为以对甲苯磺酰氯活化截短侧耳C14支链上的羟基得对甲苯磺酰化截短侧耳素，碱性条件下与2-氨基-S5-巯基-1,3,4-噻二唑反应在截短侧耳素C14支链引入噻二唑环，得到化合物18，最后再与苯环上有不同取代基的苯甲酰氯进行酰基化反应，得到化合物(1～17)(图1)。所有产物经柱色谱分离得到高纯度的18种含有不同取代基的截短侧耳素衍生物，18种化合物经高分辨质谱进行结构确证。

1.3 药敏试验

1.3.1 培养基的配制 鸡毒支原体培养基(pH7.8)：称取鸡毒支原体基础培养基47.4 g，加热溶解于1 000 mL蒸馏水中，116 ℃高压灭菌30 min，冷却至45 ℃左右加入150 mL无菌猪血清(猪血清56 ℃灭活30 min)，以及L-半胱氨酸0.125 g和还原型辅酶Ⅰ0.125 g，用无菌1 mol·mL-1NaOH溶液调pH至7.8左右。密封放4 ℃保存，于1个月内使用。

1.3.2 鸡毒支原体菌株S6的启用 鸡毒支原体标准株S6，购自中国兽医药品监察所。取鸡毒支原体标准株S6冻干粉接种于鸡毒支原体液体培养基中，置于5%(φ)二氧化碳培养箱，37 ℃培养4～6 d，当培养基颜色由红色变为橙黄色时，传代2次，然后扩大培养。

1.3.3 抗菌药原液的配制 分别称取0.025 6 g截短侧耳素衍生物 1～18于10 mL容量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺溶解,定容，使药物质量浓度均为2 560 μg·mL-1，同时按照相同的方法配制质量浓度为2 560 μg·mL-1的泰妙菌素作为对照，用0.22 μm滤膜过滤除菌，小管分装，-20 ℃保存备用。

试剂及反应条件：(ⅰ)对甲苯磺酰氯，吡啶，0 ℃，3 h，产率56.3%；(ⅱ) 2-氨基-5-巯基噻二唑，NaOH，0 ℃，2 h ; (ⅲ)乙酸乙酯，三乙胺，50～70 ℃，48 h。

图1 截短侧耳素衍生物的合成路线

Fig.1 The synthetic route of pleuromutilin derivatives

1.3.4 化合物最小抑菌质量浓度的测定 采用2倍稀释法每排双面板取无菌2 mL EP管15个，每个编号的衍生物对应1排双面板。在第1管中加入0.9 mL液体培养基，其余各管加入0.5 mL，取配好的药液0.1 mL加入第1管中充分混合后，取0.5 mL混合液加入第2管中，依此类推，最后吸出0.5 mL弃去，然后每管中加入106CFU·mL-1的菌液0.5 mL，盖好盖子，得到化合物浓度依次2倍递减的15个液体培养基。另作空白对照，37 ℃条件下培养，观察鸡毒支原体的生长情况，以分析18种截短侧耳素衍生物的最小抑菌质量浓度(Minimum inhibitory concentration，MIC)。

2 结果与分析

2.1 结构确认

因合成路线、原料确定，部分化合物经过类似的合成路线进行合成，且已完成结构表征[12-13]，本研究合成的18种截短侧耳素衍生物仅由高分辨质谱进行结构确证。以化合物18(C24H35N3O4S2)(图2)为例，高分辨质谱分析表明其精确质量数理论值为494.214 2，所得化合物精确质量数实测值为494.216 4，表明合成所得产物为目标化合物。所有化合物精确质量数如表1所示。

图2 化合物18高分辨质谱图

2.2 最小抑菌质量浓度

用试管2倍稀释法，对18种截短侧耳素衍生物及泰妙菌素进行鸡毒支原体抑制活性评价，试验结果如表1所示。

表1 18种衍生物精确质量数和18种衍生物及泰妙菌素对S6支原体MIC结果

1)苯环上不同取代基的苯甲酰氯。

由表1可知，化合物12、15及17对鸡毒支原体的MIC为0.125 0 μg·mL-1，化合物1、3、4、6、13及16对鸡毒支原体的MIC为0.250 0 μg·mL-1，化合物2、5、7～11及14对鸡毒支原体的MIC为0.500 0 μg·mL-1，化合物18与泰妙菌素对S6鸡毒支原体的MIC均为0.015 6 μg·mL-1。

3 讨论与结论

截短侧耳素衍生物与细菌核糖体50s亚基相互作用发挥抑菌作用，其C14支链能影响该类化合物的抗菌活性[15]。本文结果显示，C14支链引入噻二唑片段的截短侧耳素衍生物18对鸡毒支原体抑制活性最强，与泰妙菌素相当。化合物18氨基被苯甲酰基化后所得化合物17活性减弱，可能因化合物17中苯甲酰基的吸电子作用降低了噻二唑环上酰胺氮原子电子云的密度，减弱了化合物17中C14支链与核糖体50s亚基中碱基的相互作用进而降低了化合物17的活性。而化合物1～11分子中的苯甲酰基上均有强吸电子基团(氟、氯、硝基及三氟甲基)，与化合物17相比，分子中噻二唑及酰胺氮原子电子云密度进一步降低，可能因此导致化合物1～11对鸡毒支原体的抑制活性均弱于化合物17。Shang等[13]研究表明在化合物17苯环上引入氨基能增强目标化合物对MRSA等的抑菌活性，鉴于氨基为给电子基团，我们分别在17苯环上引入甲基和甲氧基这2种给电子基团，以期增强目标化合物抑制鸡毒支原体活性，但所得化合物仅12及15与17抑菌活性相当。与甲基及甲氧基相比，氨基除了具有给电子效应外，还可能与核糖体上碱基存在强相互作用[12-13]，故而使含氨基衍生物抑菌活性得以增强。本研究并未合成苯环具有氨基取代的衍生物，因而在发挥抗支原体活性时，氨基是否仍具有这一特点尚需在进一步的试验验证。

本研究在截短侧耳素C14支链上引入噻二唑片段，合成了18种截短侧耳素衍生物，研究了取代基团对衍生物抑制鸡毒支原体活性的影响。化合物18对支原体的抑菌活性最强，与泰妙菌素相当。Zhang等[16]研究表明化合物18以948.15 mg·kg-1剂量饲喂小鼠无明显急性毒性；以5 mg·kg-1剂量连续28 d饲喂小鼠无明显蓄积毒性，且其对MRSA感染小鼠的死亡保护率与泰妙菌素相当。以上研究结合本试验中化合物18对S6支原体的体外抑菌结果表明，化合物18有望作为兽医临床抗鸡毒支原体感染的候选药物进行进一步研发。此外，本文所得18种化合物S6支原体抑制活性的构效关系，可为C14支链含噻二唑截短侧耳素类衍生物的设计及后续研究提供依据。

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【责任编辑 庄 延】

Influence of substituent groups on the antibacterial effect of pleuromutilinderivatives with thiadiazole moiety againstMycoplasmagallisepticum

FANG Xi, WANG Wenxiang, GAO Meiling, YANG Tao, LIU Yahong, TANG Youzhi

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Veterinary Drugs’ Research and Safety Evaluation/College ofVeterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

【Objective】 To provide experimental data for the research and development of new antibacterials againstMycoplasmagallisepticum.【Method】Eighteen analogues of pleuromutilin possessing thiadiazole moieties at the C14 chains were synthesized. High resolution mass spectrometry was used to verify the structures of the synthesized compounds. Influence of substituted benzene on the antibacterial effects of these pleuromutilin derivatives againstM.gallisepticumwere investigated byinvitrodrug sensitivity tests.【Result】The obtained MIC values revealed that analogues 12, 15 and 17 exhibited potential antibacterial activities againstM.gallisepticumS6 strain with MIC of 0.125 0 μg·mL-1. Analogue 18 and Tiamulin (control) showed the most potent antibacterial activities against S6 straininvitrowith MIC of 0.015 6 μg·mL-1. Analogue 17, which was the product from benzoylation of the amino group of analogue 18, had lower antibacterial activity compared with analogue 18.【Conclusion】 Analogue 18 can be used as a candidate compound for further development of antibacterials againstM.gallisepticum.

Mycoplasmagallisepticum; pleuromutilin derivative; thiadiazole moiety; high resolution mass spectrometry; minimum inhibitory concentration (MIC)

2016- 06- 21 优先出版时间：2017-04-12

方 茜(1991—)，女，硕士研究生， E-mail：15989177877@163.com；通信作者：汤有志(1983—)，男，副教授，博士， E-mail: youzhitang@scau.edu.cn

广东省自然科学基金(S2012030006590)；广州市珠江科技新星专项(2014J2200042)

S852.62

A

1001- 411X(2017)03- 0021- 05

优先出版网址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170412.1427.012.html

方 茜， 王文湘， 高美龄， 等.取代基团对含噻二唑片段截短侧耳素衍生物抑制鸡毒支原体活性的影响[J].华南农业大学学报，2017,38(3):21- 25.