APP下载

采用在体单向肠灌流模型研究荷叶多成分整体的肠渗透性

2017-05-11尹秀文侯成波陈江鹏潘孟李雪莲

中国中药杂志 2017年8期
关键词:渗透性荷叶

尹秀文+侯成波+陈江鹏+潘孟+李雪莲+王子禹+董玲

[摘要] 研究荷叶多成分整体的肠渗透性,明确荷叶成分间吸收过程中的相互作用。采用大鼠在体单向灌流法。结果表明,荷叶中荷叶碱、去甲基荷叶碱、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚7种单体成分的有效渗透系数(Peff)大于0.5×10-4 cm·s-1,在生物药剂学分类系统(biopharmaceutics classification system,BCS)肠渗透属性中,属高渗透性成分,而儿茶素、金丝桃苷为低渗透性成分。然而,在荷叶总提取物多成分环境下,成分的渗透行为发生了变化,对荷叶中不明确成分进行半定量分析发现,在多成分环境下,可标识的9个成分中有3个成分Peff小于0.5×10-4 cm·s-1。在多成分环境下,7个未知成分中,3个成分属于高渗透性成分,4个成分属于低渗透性成分。该研究初步明确了荷叶中多成分整体的肠渗透性,为揭示中药多成分环境下的吸收机制奠定一定的基础。

[关键词] 单向肠灌流;渗透性;荷叶;中药生物药剂学分类系统

Overall intestinal permeability of multiple components in

lotus leaf by in situ single pass intestinal perfusion models

YIN Xiu-wen, HOU Cheng-bo, CHEN Jiang-peng, PAN Meng, LI Xue-lian,WANG Zi-yu, DONG Ling*

(Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

[Abstract] To investigate the overall intestinal permeability of multiple components in lotus leaves and make clear the interaction in composition absorption process. Rat single-pass intestinal perfusion technique was used, and the results showed that the Peff values of nuciferine, demethylanuciferine, rutin, quercetin, kaempferol from lotus leaf were greater than 0.5×10-4 cm·s-1. In the biopharmaceutics classification system (BCS) intestinal permeability property, these ingredients were high permeable components, while the hyperin was low permeable component. However, in the multi-component environment of the lotus leaf extract, component permeation was changed. Semi quantitative analysis of the unclear components showed that under the multi-component environment, four in seven components with relatively high contents had a Peff value less than 0.5×10-4 cm·s-1, indicating these 4 components were of low permeability, while other 3 components were of high permeability. The results could be valuable to make clear the overall intestinal permeability of multiple components in lotus leaf, and lay a foundation for studying the mechanism of the lipid-lowering effect of lotus leaf.

[Key words] single-pass intestinal perfusion(SPIP); permeability; lotus leaf; biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica

口服作為药物最常见的服用方式,其胃肠道吸收过程非常复杂。药物的水溶解性及肠渗透性是影响吸收的主要因素[1],也是影响药物生物利用度的关键因素之一。“生物药剂学分类系统(biopharmaceutics classification system,BCS)”是根据药物的水溶解性及肠渗透性高低,对药物进行分类的一种科学框架或方法[2-3]。BCS的提出是基于单一成分化学药物,而中药与化药口服吸收的本质和核心是一致的。成分在肠道吸收受很多因素影响,对中药整体肠吸收研究,需要经过单成分到多成分环境的递进过程,才能明确成分在多成分环境下的吸收变化差异。基于中药的多成分属性本课题组提出了中药生物药剂学分类系统(biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica,CMMBCS)[4]。本文在研究中药多成分环境下的渗透性时,首先要对吸收的目标成分进行锁定,同时要充分考虑多成分环境下其他成分对目标成分的影响,然后再对吸收成分的吸收程度进行系统分析和定量研究。

小肠是药物吸收的重要部位,目前,预测药物小肠吸收的方法主要有分为体外法、离体法、在体法3种[5-7]。体外法主要有Caco-2细胞模型、平行人工膜等,离体法主要采用翻转肠囊实验,离体法则涉及翻转肠囊法。体内法通常采用经典的单向肠灌流法、以及肠灌流并行采血法。本课题组前期通过离体法翻转肠囊实验研究了荷叶中荷叶碱、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、紫云英苷的肠渗透性,但由于儿茶素、去甲基荷叶碱,山柰酚等成分在荷叶总提取物中含量本身比较低,翻转肠囊实验未能进一步探索其肠渗透情况,该方法对成分的判断有失准确[8]。为了进一步对荷叶成分进行肠渗透性定量分析,本研究采用大鼠在体单向肠灌流(SPIP)实验对荷叶中确定单成分进行灌流实验,该方法较好地模拟人体的体内环境,不损伤研究部位的循环系统和生理环境,且结果与人体试验结果相关性良好[9-10]。古籍记载荷叶具有减肥降脂的功效[11],荷叶多成分是通过多靶点发挥降脂减肥作用[12-14]。本研究选用荷叶为研究对象,采用在体单向肠灌流模型,研究荷叶多成分整体的肠渗透性,明确荷叶多成分中的易吸收透过肠壁和难于透过肠壁屏障的成分,为中药生物药剂学分类系统的后续研究提供一定的理论和技术参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪(SPD-20A型紫外检测器,SIL-20A自动进样器,日本岛津公司);BT-25S电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司);DZKW-4 电热恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司);KH7200DB型数控超声波清洗器(昆山超聲仪器有限公司);STARTER2100实验室pH计(奥豪斯仪器上海有限公司);注射泵(LSP02-1B,保定兰格恒流泵有限公司);高速冷冻离心机(GL-21M,上海沪湘仪离心机有限公司)。

1.2 药物与试剂

荷叶药材购自中国北京同仁堂(集团)有限责任公司,经北京中医药大学王晶娟副教授鉴定为睡莲科植物莲Nelumbo nuifera Gaertn的干燥叶,对照品叶碱(批号J04M6Y1,上海源叶生物科技有限公司)、芦丁(批号Y05M6S1,上海源叶生物科技有限公司)、金丝桃苷(批号08916-418,美国ChromaDex)、异槲皮苷(批号HJ0604XA13,上海源叶生物科技有限公司)、槲皮素(批号Y26D5Y1,上海源叶生物科技有限公司)、紫云英苷(批号KS0910CB14,上海源叶生物科技有限公司);乙腈购买于美国Fisher公司(色谱级);磷酸、氯化镁、氯化钠、磷酸二氢钠、氯化钾、氯化钙、碳酸氢钠、葡萄糖购买于北京化工厂(分析级);娃哈哈纯净水购买于娃哈哈集团公司(中国杭州)。

1.3 动物

SD大鼠,雄性,体重200~250 g,斯贝福(北京)实验动物科技有限公司提供,许可证号SCXK(京)2011-0004。

2 方法

2.1 溶液配制

2.1.1 对照品溶液

精密称取各对照品5.0 mg于10 mL量瓶,甲醇稀释至刻度,摇匀,得500 mg·L-1对照品储备液。精密量取各储备液3.0 mL于50 mL量瓶,甲醇稀释至刻度,摇匀后,精密量取各对照品适量于50 mL量瓶,甲醇定容,摇匀,即得一定浓度的混合对照品溶液。

2.1.2 Krebs-Ringer′s营养液(K-R液)

称取NaCl 7.8 g,KCl 0.35 g,CaCl2 0.37 g,NaHCO3 1.37 g,NaH2PO4 0.32 g,MgCl2 0.02 g,葡萄糖1.4 g,加去离子水定容至1 000 mL,即得。

2.1.3 荷叶提取物溶液的制备

荷叶药材粉碎,得粗粉,称取5 g,以60%乙醇固料比1∶30回流提取1 h,提取液趁热抽滤,放冷定容至250 mL,摇匀,过0.45 μm微孔滤膜,取续滤液供HPLC分析。

2.1.4 灌流液制备

称取适量的荷叶对照品,以K-R液溶解得到不同浓度的肠灌流液。取荷叶醇提液用K-R液稀释至一定生药浓度的灌流液。

2.2 荷叶多成分HPLC分析方法的建立

2.2.1 色谱条件

2.2.1.1 荷叶可标识单成分色谱条件 Phenomenex Gemini C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱温30 ℃;进样量20 μL;流动相水(A,含0.025%磷酸)-乙腈(B),梯度洗脱。各成分检测波长、流速、流动相比例见表1。

2.2.1.2 荷叶提取物色谱条件 Phenomenex Gemini C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);检测波长270 nm;流速0.8 mL·min-1;柱温30 ℃;进样量20 μL;流动相0.025%磷酸(A)-乙腈(B),梯度洗脱 (0~2 min,98∶2;2~5 min,98∶2~92∶8;5~8 min,92∶8;8~11 min,92∶8~88∶12;11~17 min,88∶12;17~25 min,88∶12~85∶15;25~43 min,85∶15;43~61 min,85∶15~74∶26;61~70 min,74∶26;70~89 min,74∶26~25∶75;89~90 min,25∶75;90~98 min,25∶75~98∶2;98~120 min,98∶2)。

2.2.2 定量分析方法学考察

2.2.2.1 专属性考察 荷叶可标识单成分:分别取空白肠灌流液、含对照品灌流液进行HPLC检测分析,空白肠灌流液对荷叶定量成分检测无影响,说明方法专属性良好,结果见图1。

荷叶多成分:分别取空白肠灌流液、含混标对照品灌流液进行HPLC检测分析,空白肠灌流液、荷叶总提取物溶液对荷叶定量成分检测无影响,说明方法专属性良好,结果见图2。

2.2.2.2 线性与范围 荷叶可标识单成分:分别量取一定体积0.5 g·L-1的对照品储备液于容量瓶中并定容,配成不同浓度的对照品溶液,分别精密取上述对照品溶液20 μL注入高效液相,记录各成分峰面积,以药物质量浓度X(mg·L-1)为横坐标,峰面积Y为纵坐标,进行线性回归。结果表明各对照品在相应浓度范围内线性关系良好,见表2。

荷叶多成分:分别量取一定体积0.5 g·L-1的对照品储备液于量瓶中并定容,配成不同浓度的混标溶液,分别精密取上述混标溶液20 μL注入高效液相,记录峰面积,以药物质量浓度X(mg·L-1)为横坐标,峰面积Y为纵坐标,进行线性回归。结果表明各对照品在相应浓度范围内线性关系良好,结果见表3。

2.2.2.3 精密度考察 荷叶可标识单成分:分别配制不同浓度的对照品溶液,重复进样6 针,记录峰面积,计算RSD。各浓度下RSD均小于2%,说明方法精密度良好。

荷叶多成分:分别配制不同浓度的混合对照品溶液,重复进样6针,记录峰面积,计算RSD。各浓度下,RSD均小于2%,说明方法精密度良好。

2.2.2.4 重复性考察 荷叶可标识单成分:分别精密量取对照品母液于50 mL量瓶,以K-R′s试液定容,摇匀后,以甲醇稀释至一定比例,样品通过0.22 μm微孔滤膜后进行HPLC检测,记录峰面积,并计算RSD,所有样品重复操作5次。结果表明RSD均小于2%,说明方法重复性良好。

荷叶多成分:分别精密量取对照品母液于50 mL量瓶,以K-R′s试液定容,摇匀后即得一定濃度的混合对照品溶液,以甲醇稀释至一定比例,样品过膜后进行HPLC检测,记录峰面积,计算RSD,样品重复操作6次。结果RSD<3%,说明方法重复性良好。

2.2.2.5 回收率考察 荷叶可标识单成分:取空白肠灌流液,分别加入不同量的对照品,以HPLC测定其含量,计算回收率,样品回收率RSD在95.28%~100.8%,说明方法准确度良好。

荷叶多成分加样回收率考察:取指标成分已知浓度的荷叶提取物肠灌流液,分别加入不同量的对照品,以HPLC测定其含量,计算回收率,结果表明回收率在86.85%~105.7%。

2.3 荷叶单成分肠渗透性研究

2.3.1 大鼠在体肠灌流操作方法

大鼠禁食不禁水12~18 h,腹腔注射10%水合氯醛(3 μL·g-1)麻醉。沿中线打开腹部,选取合适长度肠段,用生理盐水冲洗干净。注射泵与肠段入口端相连,设置灌流速度为0.2 mL·min-1,持续灌流约30 min吸收达到稳定后重新计时,每隔15 min用已知质量的小瓶在肠段出口端收集流出药液,计算收集前后小瓶重量称量差,同时测定收集液的密度,以此方法来进行灌流液的体积校正。实验结束后剪下被灌流的肠段并处死大鼠,测量肠段的长度及内径。HPLC测定流出灌流液中待测成分含量。

2.3.2 在体单向肠灌流法相关计算方法[15]

在体灌流法肠有效渗透系数Peff计算公式如下。

Peff=-Qin·ln(Cout(cor)/C0)2πrL

Qout=Mout/Doutt

Cout(cor)=CoutQoutQin

Qin为灌流液流速(mL·min-1);C0为灌流液荷叶成分的初始浓度(mg·L-1);L是灌流肠段长度(cm);r为灌流肠段半径(cm);Cout(cor)荷叶成分灌流收集液校正浓度(mg·L-1);Qout为灌流液流出的流速(mL·min-1);Cout为灌流收集液中荷叶成分的浓度(mg·L-1);Dout为灌流收集液密度(g·mL-1);t为取样周期(min);Mout为灌流收集液质量(g)。

3 结果

3.1 荷叶可标识单成分、多成分HPLC图的建立

3.1.1 荷叶可标识单成分HPLC图的建立

3.1.1.1 荷叶可标识单成分HPLC图 本研究建立了荷叶可标识单成分HPLC图谱,空白肠灌流液、荷叶总提取物溶液对荷叶定量成分检测无影响,说明方法专属性良好,结果见图1。

3.1.1.2 荷叶可标识单成分标准曲线绘制 以药物质量浓度X(mg·L-1)为横坐标,峰面积Y为纵坐标,进行线性回归,结果表明各对照品在相应浓度范围内线性关系良好,见表2,

3.1.2 荷叶多成分HPLC图的建立

3.1.2.1 荷叶多成分HPLC图 为了考察荷叶成分吸收变化情况,本研究建立了荷叶化学成分HPLC图谱,空白肠灌流液、荷叶总提取物溶液对荷叶定量成分检测无影响,说明方法专属性良好,结果见图1。

3.1.2.2 荷叶多成分标准曲线绘制 以药物质量浓度X(mg·L-1)为横坐标,峰面积Y为纵坐标,进行线性回归,结果表明各对照品在相应浓度范围内线性关系良好,见表3。

3.2 荷叶多成分肠渗透性研究

3.2.1 荷叶可标识单成分吸收

采用在体单向灌流对荷叶中明确的单成分进行渗透性研究,荷叶中可标识单体成分有效渗透系数见表4,可以看出荷叶中荷叶碱、去甲基荷叶碱、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚成分Peff大于0.5 ×10-4cm·s-1,在BCS肠渗透属性中,这些成分为高渗透性成分,而儿茶素、金丝桃苷为低渗透性成分。

3.2.2 荷叶提取物吸收情况

3.2.2.1 荷叶提取物中可标识成分吸收情况 在荷叶多成分环境下,可标识成分有效渗透系数见表5,结果表明,单成分仅有儿茶素、金丝桃苷是低渗透性药物成分,但是在多成分环境下,成分的渗透行为并不是一成不变的,去甲基荷叶碱与芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷等荷叶黄酮苷类成分整体渗透率有降低的趋势,芦丁的渗透系数出现了跨象限的现象,多成分环境下,芦丁成分由高渗透性变为低渗透性,而山柰酚渗透系数则增大。

3.2.2.2 荷叶提取物中不可标识成分吸收情况 由HPLC图,选取已知成分异槲皮苷作为内标物,计算其他较高含量成分的相对保留时间及相对含量,并计算其肠有效渗透系数,结果见图3,表6。

结果表明,其他含量比较高的成分中7个成分中,X1,X2,X6的Peff大于0.5×10-4 cm·s-1,依据BCS属于高渗透性成分,成分X3,X4,X5,X7则低于该值,属于BCS的低渗透性成分。

4 讨论

4.1 荷叶整体肠渗透性实验结果与讨论

对荷叶中已知的单成分进行了肠渗透性考察,既定成分已经有了比较明确的肠渗透归属,9个成分中仅有儿茶素与金丝桃苷的Peff小于0.5×10-4 cm·s-1,其他成分均大于该限度,儿茶素与金丝桃苷属于低渗透性成分,而其他成分为高渗透性成分。但是,在荷叶总提取物这一复杂环境下,对应成分的肠渗透性情况可能会发生变化,最为显著的是芦丁的渗透系数出现了跨象限的现象,多成分环境下,芦丁成分由高渗透性变为低渗透性,多成分环境下,荷叶中的去甲基荷叶碱与芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷等荷叶黄酮苷类成分整体渗透率有降低的趋势,而山柰酚渗透系数增大,可能是其他成分促渗作用导致。因此,研究清楚荷叶多成分在整体环境下的肠渗透性,明确多成分环境下成分吸收变化规律具有重要的意义。

4.2 基于肠渗透性的成分吸收评价研究

肠渗透性是药物进行BCS分类的基本属性之一[16],根据其强弱将药物分为高渗透性药物(强吸收成分)和低渗透性药物(弱吸收成分)[2]。就中药而言,中药成分本身渗透性有差异,同时多成分环境下也会导致渗透性产生差异,因此在考察成分渗透性时,要同时考察对单成分渗透行为和整体多成分环境对渗透性的影响。药物的渗透性差异,其吸收行为就有差异,必然导致其发挥药效的机制不同,对于高渗透性的药物,药物多是吸收进入体内发挥疗效,而对于低渗透性药物,则多是滞留在肠道内,因此在研究药物发挥疗效的机制时,对于肠渗透性差的药物,可以考虑基于肠道吸收前靶点的活性研究,而对于肠渗透性较好的药物成分,考虑其在吸收过程中以及吸收后靶点药效研究。

荷叶是经典的药食两用的减肥药材,降脂减肥的临床功效得到普遍认可,荷叶中含有大量的减肥有效成分,主要是生物碱类和黄酮类成分,还有多酚类、有机酸类成分等[17]。但其发挥减肥作用的机制尚不明确,其中脂肪酶抑制是非常典型降脂减肥机制,针对荷叶生物碱、黄酮总提取物以及部分单体成分的脂肪酶抑制活性已经有研究[18],但各成分之间协同作用,如何发挥疗效,未见文献报道。为了明确荷叶多成分的减肥降脂机制,首先对荷叶进行吸收行为考察,结果发现,荷叶多成分中有渗透性好的成分,也有肠渗透性差的成分,且多成分环境下肠渗透性受到成分间相互作用影响发生改变。因此,研究荷叶发挥降脂的机制,低渗透性成分可能因在肠道滞留时间长,结合像脂肪酶一样的肠道吸收前靶点发挥作用,而高渗透性成分如荷叶碱,可能是吸收过程中或吸收进入体内经过其他降脂靶点发挥疗效,除此之外,还要考虑荷叶多成分在发挥药效时的相互影响。综上所述,荷叶发挥减肥降脂的机制及其关系,需进一步研究。

[参考文献]

[1] Ruiz-Garcia A,Bermejo M,Moss A,et al.Pharmacokinetics in drug discovery[J]. J Pharm Sci, 2008,97(2):654.

[2] Amidon K S,Langguth P,Lennerns H,et al. Bioequivalence of oral products and the biopharmaceutics classification system: science,regulation,and public policy[J]. Clin Pharmacol Ther, 2011,90(3): 467.

[3] Oh D M,Curl R L,Amidon G L. Estimating the fraction dose absorbed from suspensions of poorly soluble compounds in humans: a mathematical model[J]. Pharm Res,1993,10(2):264.

[4] 刘洋,隗丽,董玲,等.多成分体系下中药生物药剂学分类系统的构建分析[J]. 中国中药杂志,2014,39(23):4479.

[5] 廖正根,平其能,萧伟,等. 桂枝茯苓胶囊中有效成分的大鼠在体肠吸收研究[J]. 中国天然药物,2005,3(5): 303.

[6] Kansy M,Senner F,Gubernator K. Physicochemical high throughput screening: parallel artificial membrane permeation assay in the description of passive absorption processes[J]. J Med Chem,1998,41(7): 1007.

[7] Li H,Dong L,Liu Y,et al. Biopharmaceutics classification of puerarin and comparison of perfusion approaches in rats[J]. Int J Pharm,2014,466(1): 133.

[8] 侯成波,董月柳,尹秀文,等. 荷叶多成分整体的肠渗透性研究[J]. 中国中药杂志,2016,41(7):1183.

[9] Chen X M,Li J S,Li W,et al. Intestinal absorption of the effective components of Schisandra chinensis Baill by rats single-pass perfusion in situ [J]. Acta Pharm Sin,2010,45: 652.

[10] Zakeri-Milani P,Valizadeh H,Tajerzadeh H,et al. Predicting human intestinal permeability using single-pass intestinal perfusion in rat[J].J Pharm Pharm Sci,2007,10: 368.

[11] 陶帅,景贤,吴凤莲.荷叶水煎剂对高脂血症大鼠血脂及血液流变学的影响[J]. 中医药学报,2000(6):55.

[12] 范婷婷,法鲁克,方芳,等.荷叶总生物碱降脂减肥作用的体内外试验[J].浙江大学学报:农业与生命科学版,2013(2):141.

[13] 孙晨光.论荷叶的减肥降脂作用[J].中医临床研究,2014(3):100.

[14] 薛冬娜.荷叶总黄酮提取纯化工艺及减肥降脂作用的研究[D].重庆:西南大学,2008.

[15] Li H,Dong L,Liu Y,et al. Comparison of two approaches of intestinal absorption by puerarin[J]. J Pharmacol Toxicol Methods,2014,70(1): 6.

[16] Amidon G L,Lennerns H,Shah V P,et al. A theoretical basis for a biopharmaceutics drug classification: the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability [J]. Pharm Res,1995,12(3):413.

[17] 王玲玲,劉斌,石任兵.荷叶的化学成分研究[J].天然产物研究与开发,2009(3):416.

[18] 范婷婷,法鲁克,方芳,等.荷叶总生物碱降脂减肥作用的体内外试验[J]. 浙江大学学报:农业与生命科学版,2013(2):141.

[责任编辑 孔晶晶]

猜你喜欢

渗透性荷叶
煤热解挥发物对炼焦煤塑性体渗透性的调控研究
视唱练耳课程与作曲技术理论的交叉渗透性探究
荷叶像什么
阿奇山1号岩体现场水文地质试验及渗透性评价
纺织基小口径人工血管材料的体外水渗透性研究
青藤外敷散模型家兔膝关节经穴、非经穴部位皮肤渗透性比较
荷叶圆圆
荷叶伞
荷叶游乐园
小蚂蚁喜欢躺在荷叶上