淫羊藿苷对氧糖剥夺PC12细胞单胺类递质含量的影响

莫镇涛 李文娜 翟玉荣 石京山 龚其海

(遵义医学院珠海校区药理教研室，广东 珠海 519041)

淫羊藿苷对氧糖剥夺PC12细胞单胺类递质含量的影响

莫镇涛 李文娜 翟玉荣 石京山1龚其海1

(遵义医学院珠海校区药理教研室，广东 珠海 519041)

目的 研究淫羊藿苷对氧糖剥夺PC12细胞单胺类递质紊乱的调节作用。方法 采用PC12细胞氧糖剥夺(2 h)损伤模型，将10-7、10-6、10-5mol/L淫羊藿苷预给药1 h加氧糖剥夺期间给药2 h后，用MTT法检测细胞活力，ELISA法检测细胞上清液的去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)含量。结果 10-7、10-6、10-5mol/L淫羊藿苷均能显著升高氧糖剥夺PC12细胞上清液的NE、DA、5-HT含量和细胞的活力(P<0.05)。结论 淫羊藿苷保护氧糖剥夺PC12细胞的作用可能与调节单胺类递质紊乱有关。

淫羊藿苷；PC12细胞；去甲肾上腺素；多巴胺；5-羟色胺

淫羊藿为小檗科淫羊藿Epimedium L植物，具有“温肾壮阳，强筋骨，祛风湿”的功效，常用于治疗阳痿，筋骨痿软，风湿痹痛，拘挛麻木，半身不遂等证。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分之一。近年研究表明，淫羊藿苷对脑缺血性损伤具有显著的治疗作用〔1～3〕，但具体作用机制尚不完善。单胺类递质紊乱参与了脑缺血性损伤过程，因此本课题单胺类递质的角度出发，观察淫羊藿苷对去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂 PC12细胞为崔国祯博士惠赠；DMEM高糖培养液、胎牛血清、马血清、0.25%胰酶均为Gibco公司产品；细胞培养板为 Corning公司产品；噻唑蓝(MTT)、DMSO生物工程(上海)股份有限公司，批号：0914B50、批号：0929SJB；大鼠NE(批号：BI140724123)、大鼠DA(批号：BI140722023)及5-HT ELISA试剂盒(批号:BI140723059)均为广州市佰而林生物科技有限公司公司产品；尼莫地平注射液为德国拜耳公司产品，批号：BXa2EV1；淫羊藿苷为南京泽朗医药科技有限公司产品，纯度HPLC检测为98.3%，淫羊藿苷用DMSO配成10-3mol/L溶液于-20℃储存备用，用时用Earle平衡盐溶液和细胞完全培养液分别配制成10-7、10-6、10-5mol/L药液；Earle平衡盐溶液配制：各药品浓度为116 mmol/L NaCl，5.4 mmol/L KCl，0.8 mmol/L MgSO4，1 mmol/L NaH2PO4，0.9 mml/L CaCl2和10 mg/L酚红；细胞完全培养液：5%胎牛血清+5%马血清+90% DMEM高糖培养液。

1.2 主要仪器设备 CO2培养箱(HF90)、三气培养箱(力康生物医疗科技控股有限公司，HF100)；台式冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司，KDC-140HR)、恒温箱(上海一恒科学仪器有限公司，DHP-9012)、酶标仪(美国Themo scientific公司，Multiskan Mk3)；万分之一天平(德国赛多利斯公司，BSA124S)。

1.3 方法

1.3.1 造模 PC12细胞经复苏后，用含5%的胎牛血清和5%的马血清的高糖DMEM培养液3～5 ml接种于25 cm2培养瓶并放置于37℃，5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养。当细胞长满单层后，用0.25%胰酶消化，调成细胞浓度为1×105个/ml，每孔100 μl接种于96孔板；5×105个/ml，每孔1 ml接种于6孔板中。实验分成6组，正常组和模型组加入完全培养基，阳性对照组加入含10 μmol/L 尼莫地平的完全培养基培养1 h，淫羊藿苷低、中、高剂量组分别加入含10-7、10-6、10-5mol/L淫羊藿苷的完全培养基培养1 h，除正常组外，其余各组吸弃含药完全培养基，模型组加入Earle平衡盐溶液，阳性对照组加入含10 μmol/L 尼莫地平的Earle平衡盐溶液，淫羊藿苷高、中、低剂量组分别加10-7、10-6、10-5mol/L淫羊藿苷的Earle平衡盐溶液，并放入通有1%O2，5%CO2和94%N2的37℃培养箱中培养2 h后，96孔板培养的细胞用于MTT检测，6孔板培养的细胞，取其细胞培养上清液(即氧糖剥夺后的Earle平衡盐溶液)用于ELISA检测。

1.3.2 MTT检测 每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT的完全培养液，放置于37℃，5% CO2的培养箱中再培养4 h后，吸弃细胞培养液，每孔加入150 μl的DMSO,置微量振荡器上振荡10 min，酶标仪测定波长为570 nm的OD值。

1.3.3 ELISA检测 每孔取100 μl细胞培养上清液用于检测NE、DA、5-HT。检测方法按照说明书进行，最后在450 nm测定其OD值。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，组间比较进行t检验。

2 结 果

2.1 淫羊藿苷对氧糖剥夺PC12细胞活力的影响 与正常组比较，造模后细胞活力显著降低(P<0.01)。与模型组比较，各剂量淫羊藿苷均能显著提高氧糖剥夺PC12细胞的细胞活力(P均<0.01)，见表1。

2.2 淫羊藿苷对氧糖剥夺PC12细胞NE的影响 与正常组比较，造模后细胞上清液NE、DA及5-HT含量显著降低(P<0.01)。与模型组比较，各剂量淫羊藿苷均能显著提高细胞上清液NE、DA及5-HT含量(P<0.05，P<0.01)，见表1。

2.3 淫羊藿苷对氧糖剥夺PC12细胞DA的影响 与正常组比较，造模后细胞上清液DA含量显著降低(P<0.01)。与模型组比较，各剂量淫羊藿苷均能显著提高细胞上清液DA含量(P<0.05，P<0.01)，见表1。

表1 淫羊藿苷对PC12细胞活力、细胞上清液NE、DA及5-HT含量的影响

与正常组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01，3)P<0.05

2.4 淫羊藿苷对氧糖剥夺PC12细胞5-HT的影响 与正常组比较，造模后细胞上清液5-HT含量显著降低(P<0.01)。与模型组比较，各剂量淫羊藿苷均能显著提高细胞上清液5-HT含量(P<0.05，P<0.01)，见表1。

3 讨 论

NE、DA、5-HT是中枢神经系统重要的单胺类递质，在维持大脑正常的生理功能方面起着重要作用。脑内NE具有调节体温、注意力、意识、警觉、睡眠-觉醒、焦虑和疼痛、学习和记忆、情绪、内分泌、心血管系统功能等〔4〕。脑内DA具有调节躯体活动、行为、意志、认知与情感、睡眠-觉醒、内分泌的作用〔5〕。脑内5-HT具有调节认知能力、意志、行为、焦虑和疼痛、精神情绪、听觉、内分泌、体温、睡眠等功能〔6〕。

NE、DA、5-HT等单胺类神经递质参与了脑缺血损伤过程，但这些单胺类递质在脑缺血中的作用，目前的研究结果存在分歧〔7〕。持“单胺类神经递质损伤作用”观点的学者认为，NE、5-HT等通过发挥血管活性作用，使血管收缩，加重了脑血水和脑水肿〔8〕，促使神经元内钙超载，介导神经元坏死〔9〕。DA通过介导兴奋性氨基酸作用，代谢后生成自由基等产生细胞毒性作用〔10,11〕。持“单胺类神经递质保护作用”观点的学者观察到，损害肾上腺素的中枢核团蓝斑时可加重缺血性脑损伤〔12〕；增加NE释放的药物能明显抑制脑缺血后海马及新皮层神经元坏死，而抑制NE生成的药物则使海马和纹状体神经元损伤显著加剧〔13〕。5-HT1A 受体激动剂能使细胞膜超极化，对抗缺血引起的神经元内Ca2+超载〔14〕。

PC12细胞是一种来自大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤的克隆细胞系。加入神经生长因子(培养基中加入的胎牛血清，具有神经生长因子)后，PC12细胞分化为交感神经元样细胞，呈现神经元样的形态和功能〔15〕。因其具可传代培养的特点，已被广泛用于神经药理学的研究〔16,17〕。因此本课题采用PC12细胞作为体外缺血性脑损伤的研究材料。

尼莫地平注射液是钙离子通道的拮抗药，常用于治疗缺血性脑损伤，临床疗效显著，所以采用尼莫地平作为阳性对照药。本实验结果显示,10-7、10-6、10-5mol/L淫羊藿苷对NE、DA、5-HT作用的量效关系不明显，原因可能是这三个浓度的药物对细胞的细胞活力差别不大，所以对这些指标的量效关系不明显。本研究结果显示，正常PC12细胞的上清液有一定的NE、DA、5-HT含量，它们在维持细胞的正常生理功能起着重要的作用。PC12细胞氧糖剥夺后，细胞上清液的NE、DA、5-HT含量显著下降，原因可能是氧糖剥夺后细胞能量代谢障碍〔18〕，单胺类递质的合成和释放受到抑制。而淫羊藿苷和尼莫地平给药后，氧糖剥夺PC12细胞的NE、DA、5-HT的含量与模型组比较，显著升高，表明淫羊藿苷可能通过减轻钙离子超载，减轻细胞损伤，进而显著恢复NE、DA、5-HT的合成和释放作用。

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〔2016-01-06修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-11-0927)；贵州省联合基金重点项目(黔科合J字LKZ〔2013〕04号)；遵义医学院博士启动基金(F-590)；珠海市优势学科建设项目(2015年)

龚其海(1975-)，男，博士，教授，硕士生导师，主要从事神经药理学研究。

莫镇涛(1983-)，男，博士，副教授，主要从事中医药治疗脑病机制研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)08-1852-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.013

1 遵义医学院基础药理省部共建教育部重点实验室