外泌体的生物学功能及其研究方法

徐孝东 综述 刘志红 审校

·基础医学·

外泌体的生物学功能及其研究方法

徐孝东 综述 刘志红 审校

外泌体(exosomes)是由细胞中的内涵体所分泌的一类直径40～150 nm的微小囊泡，可通过受体介导的交互作用直接刺激靶细胞，或通过向靶细胞转移各种生物活性分子等方式发挥其生物学功能。近年越来越多的研究投向利用exosomes进行疾病诊断、治疗及预后判断。然而目前对exosomes的分离及纯化方法尚存在一些技术上的制约，缺乏公认的标准，在一定程度上影响了exosomes的研究及其应用。本文就exosomes的研究现状和分离、纯化方法方面做一简要综述。

exosomes 肾脏疾病

Johnstone等[1]在1987年首次在网织红细胞培养液中发现并报道外泌体(exosomes)，此后研究相继发现exosomes可由多种细胞(如树突状细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞等)释放和分泌，并广泛存在于外周血、尿液及腹水等体液中，一度被认为是细胞为维持自身生存而被释放到外界的废弃物[2]。后续研究发现，B淋巴细胞来源exosomes具有促进T淋巴细胞增殖、活化和抑制肿瘤细胞生长等能力[3]，表明exosomes不仅是细胞的代谢产物，而且在机体生理病理过程中扮演一定的生物学功能。

exosomes生物学功能

exosomes主要经细胞核内体途径生成(图1)[4]。当细胞经胞吞作用将外源性抗原吞入并形成早期核内体后，随即向内出芽形成管腔状囊泡，并选择性地分拣细胞质内的蛋白及脂质成分，形成晚期核内体，即具有动态亚细胞结构的多囊体，多囊体去向主要有3个方面：(1)直接与溶酶体结合降解内载物；(2)接受细胞质中的大分子和囊泡结构形成内涵体，内涵体与溶酶体融合将内载物降解；(3)以Ca2+依赖的方式与细胞膜融合，将其内部所包含的囊泡结构释放至细胞外基质中，即形成exosomes。细胞所分泌的exosomes进入外环境后，可通过自分泌或旁分泌途径被细胞吸收，也可经循环系统被远距离靶组织或器官所吸收。而且，不同细胞来源exosomes表面可携带相似的保守蛋白(CD9、CD63、CD81等)，作为exosomes标志物对其分析和鉴定；此外，exosomes还携带来源细胞相关的特异性生物学物质，这些物质不仅能反映来源细胞类型，更重要的是还与来源细胞的生理功能或病理改变密切相关，目前以exosomes为代表的体液活检已可用于对肿瘤患者的早期诊断及病情监测等。

exosomes由磷脂双分子层膜和其包裹的蛋白质、脂类及核酸等大分子生物信息物质所构成，可作为纳米载体来介导细胞间的信息传递，而发挥信息传递作用的方式主要由以下4种：(1)exosomes作为信号复合物，通过配体-受体介导的方式刺激受体细胞。例如中性粒细胞来源的exosomes可通过表达Mac-1分子来激活血小板，促进凝血进程[5]；(2)exosomes在细胞间转移受体。如血小板来源exosomes可将黏附分子CD41转移到内皮细胞，增强内皮细胞的连接功能[6]；(3)exosomes向受体细胞转移功能蛋白或传染性颗粒。肿瘤细胞可通过exosome将HSP70转移到自然杀伤(NK)细胞，诱导NK细胞激活，促进机体发挥抗肿瘤免疫作用[7]；(4)exosomes通过膜融合方式向受体细胞传递mRNA、microRNA 或转录因子等遗传信息。一旦exosomes被受体细胞所接受后，其内载脂质、蛋白质及核酸等成分即可通过改变受体细胞内转录和翻译等程序来影响受体细胞表型和功能的改变。如exosomes可通过介导let-7a来降低肿瘤细胞的增殖水平，发挥机体抗肿瘤作用[8]。

图1 exosomes的生成途径[4]细胞外环境的改变可导致细胞发生内吞作用形成早期核内体，早期核内体经历成熟后形成多泡体或晚期核内体，随后细胞膜发生内陷并将exosomes释放至胞外

exosomes的分离纯化方法

目前exosomes在疾病早期诊断和靶向治疗方面展现出日趋重要的作用，但对其分离和纯化方法尚无统一标准。目前较为常用的方法包括差速离心法、蔗糖密度梯度离心法、磁珠分选法、微流控技术和提取试剂盒等，而不同提取方法获得exosomes产量、纯度和颗粒完整性等方面差异较大[9]。

差速离心法 是目前较为公认的分离exosomes的方法，且被广泛用于细胞培养液及体液exosomes的分离。尽管不同实验室的分离步骤有所差异，但主要步骤包括：(1)首先对样本低速离心(300g，10 min)，去除细胞及大的颗粒；(2)对上清液进行高速离心(2 000～10 000g，30 min)，去除死亡细胞及细胞碎片；(3)最后进行超速离心(～100 000g， 70 min)，所得沉淀即为exosomes。但此方法所获得exosomes纯度低，常伴杂蛋白污染，若想提高exosomes纯度，可用PBS重悬后重复离心一次。然而，差速离心法不仅耗时，而且会很大程度降低exosomes 产量和破坏其形态学结构，对后续功能学研究带来一定影响[10]。

蔗糖密度梯度离心法 根据不同物质密度不同进一步纯化由差速离心法所得到的exosomes。exosomes在蔗糖溶液中的浮选密度为1.08～1.22 g/ml，而微泡浮选密度为1.18～1.25 g/ml，所以可根据需要来配置不同密度梯度的蔗糖溶液对exosomes进一步纯化，主要步骤如下：首先重悬差速离心法所获得的exosomes，并加入适当浓度的蔗糖溶液，然后对其超速离心(100 000g，70 min)；离心结束后，抽取适当浓度蔗糖溶液，用PBS 稀释后再次超速离心，所得沉淀即为纯化后的exosomes。此法所获得exosomes纯度较高，而且蔗糖垫还可保护超速离心力对exosomes结构的破坏，适用于exosomes形态学的鉴定；但此方法前期准备工作繁杂，耗时，且产量较低[9]。

免疫磁珠法 通过用抗体标记磁珠识别exosomes表面特异性标记分子来对其进行分离，其主要步骤包括[11]：首先将待测样本与抗体包被的免疫磁珠混匀，室温孵育后将待分离样本缓缓加入到分离柱中；然后将分离柱移出磁性分离器，并用缓冲液冲洗exosomes。这种方法简单省时，且分离纯度较高；但并不适用于大体积样本的分离，且分离得到的exosomes 活性受到一定影响，不利于后续功能学研究[9,11]。

微流控技术 是在微观领域研究和操控液体流动的技术，这种微流控技术和微型化的芯片装置对于临床诊断和血液分析非常有用。微流控装置可利用exosomes与抗体包被界面的特异性结合来对其进行分离。将待测样本加入装置后，装置内微型泵促使液体流过芯片，在流动过程中达到分离exosomes的目的[12]。该分离方法具有快捷、省时、高效的特点，但样品引入前处理研究不成熟，而且仪器昂贵，不适合普通实验室和体积较大样本的分离[9]。

流式细胞分选法 在功能水平上对生物颗粒或单细胞进行定量分析分选的一种高效检测仪器，通过检测生物颗粒表面的发光度或荧光散射程度来达到分离和分选的目的。与传统分选方法相比，流式分选法具有极高的精确度，而且可同时标记多种荧光抗体来分选体液中特定细胞来源的exosomes[13]；目前我们实验室已成功建立起一套从患者外周血或尿液中分选淋巴细胞或足细胞来源exosomes的方案(未发表资料)。此提取方法不仅纯度高，还能特异性分选某种细胞来源的exosomes，适合后续功能学研究。但仪器价格昂贵，不适合大体积样本的分选。

ExoQuickTM试剂盒 由美国Biosciences公司研究的成熟试剂盒，作用原理至今尚未公开，但此试剂盒能够克服传统方法耗时长和产率低的缺点。通过比较发现，使用ExoQuickTM试剂盒得到的exosomes纯度及数量方面要明显高于其他方法[14]。此方法具有快捷、省时和高效的特点，但价格较昂贵，限制了实验室及临床上的使用。目前市场上各类exosomes提取试剂盒分离效果良莠不齐，尚无绝对能满足从各类样品中分离到理想exosomes的方法或试剂盒。

exosomes与疾病的关系

exosomes与肿瘤 近年来针对exosomes与疾病诊疗的研究逐年增长，而70%以上是在肿瘤学领域。研究表明，机体所有类型体液均可检出exosomes的存在，且exosomes含有来源细胞特异性的标志分子，所以通过分析肿瘤细胞所释放的exosomes分子特征就可部分反映其来源细胞表型[15]。如exosomes携带的肿瘤特异性抗原或miRNA等可以作为肿瘤标志物应用到临床诊断中。Melo SA等发现，胰腺肿瘤患者外周血中Glypican-1+exosomes所占比例及数量要明显高于健康对照者，而且用外周血中Glypican-1+exosomes诊断胰腺肿瘤患者的特异性及敏感性要优于传统诊断指标CA19-9[15]。MiR-141在前列腺肿瘤患者外周血中主要以exosomes包裹的形式存在，且用exosomes内miR-141的水平更能显著性地区分恶性肿瘤与良性肿瘤间的差异[16]。

除了用于早期诊断生物标志物，肿瘤细胞来源exosomes对还可影响机体抗肿瘤免疫和肿瘤生长[17]。研究发现，肿瘤患者体内树突状细胞可对肿瘤细胞来源的exosomes进行加工处理，并将其以MHC-抗原肽复合物形式提程给T细胞，诱导T细胞激活，增强机体抗肿瘤免疫水平[17]。肿瘤细胞来源exosomes还可直接诱导肿瘤细胞发生凋亡，如胰腺肿瘤患者肿瘤细胞所分泌的exosomes可上调肿瘤细胞内Bax表达水平，促进肿瘤细胞凋亡[18]。在晚期肿瘤患者研究中，更多的证据肿瘤细胞所分泌的exosomes具有促进肿瘤发生发展的作用。如黑色素瘤患者肿瘤细胞来源exosomes高水平表达FasL，并可通过Fas-FasL介导的方式上调Jurkat T细胞的凋亡水平，从而对机体抗肿瘤免疫起到一定拮抗作用[19]。

exosomes与肾脏疾病 有关exosomes与肾脏疾病的研究相对较少。目前主要是通过肾小球滤过率、肌酐清除率、血清肌酐和尿蛋白定量等指标来评估肾脏功能，仍缺乏疾病早期诊断和反映疾病进展及预后的标志物。肾穿刺活检能够为疾病诊断、判断病情及预后提供重要的组织学依据。但是，作为一种创伤性检查，无法将其用于实时动态的疾病观察中。

在寻找新生物标志物的过程中，尿液标本因取材简便、来源丰富，有着很大的优越性。但尿液组分复杂，其中含量丰富却缺乏特异性的成分势必会干扰量微但特异性强的组分检测，而尿液中exosomes(uExos)却因富集相对特异组分而克服了该劣势。研究证实所有肾脏细胞均可分泌exosomes，所以通过对uExos进行组学分析即可寻找出肾脏特异性的生物标志物。如肾小管疾病方面，急性肾损伤(AKI)小鼠模型中uExos中胎球蛋白A、活化转录因子3[20]和足细胞骨架巢蛋白[21]在损伤早期即出现高表达，比传统指标血清肌酐提前18～48h出现改变；另外，uExos中水通道蛋白1(AQP-1)及钠氢交换体在疾病早期出现下降，与传统检测指标钠排泄分数及尿视黄醇结合蛋白相比具有更高的敏感度和特异度[22]。其次，uExos在肾小管通道损伤或突变缺失相关的家族性高钾性高血压患者[23]等疾病诊断方面均显示出具有提高早期疾病诊断率的优势。如在经典肾小管酸中毒囊泡型H+-ATPase B1亚基(V-ATPase B1)基因敲除小鼠模型中显示，uExos数量与肾组织中的V-ATPase B1 mRNA 和AQP-2 mRNA 表达水平具有显著相关性[24]。另外，机体肾小球来源的exosomes可源源不断地释放到尿液中，所以uExos改变可作为诊断肾小球疾病的生物标志物。研究发现，uExos中WT-1表达水平在局灶节段性肾小球硬化(FSGS)小鼠模型中显著上调，并早于蛋白尿的出现[20]。而且临床实验也证实，FSGS患者uExos中WT-1水平较正常对照者显著上调，且FSGS患者经激素治疗后，激素敏感型患者uExos中WT-1水平较激素抵抗者显著下调[25]。结果提示，uExos中WT-1水平可用作预测FSGS疗效及疾病进展相关的生物标志物应用到临床中。另外，有研究表明uExos中miRNA也可作为生物标志物应用到临床，如慢性肾脏病患者uExos中miR-29及miR-200水平较正常对照者相比明显下调，且下调水平与肾功能、小管-间质纤维化损伤程度具有显著相关性[26]。上述研究均提示uExos可作为肾脏早期诊断的生物标志物应用到临床中。

近年来，exosomes除可以作为生物标志物外，将其作为新兴肾脏疾病的干预目标和靶向治疗载体方面也有了新进展。体内外研究显示，骨髓细胞、间充质干细胞(MSC)和内皮祖细胞来源的exosomes能介导miRNAs的靶向运输并促进小鼠AKI后形态学和功能上的恢复[27-28]。人MSC-exosomes可降低顺铂诱导的氧化应激强度和肾脏上皮细胞凋亡[29]。缺血/再灌注(I/R)诱导的AKI小鼠模型中，内皮集落形成细胞来源的exosomes可显著降低血清肌酐、肾小管坏死、巨噬细胞浸润、氧化应激和肾组织细胞凋亡水平，对肾脏I/R损伤起到一定保护作用[30]。其次，给链脲霉素诱导的糖尿病肾病大鼠连续尾静脉注射人尿液来源干细胞所分泌的exosomes能显著降低其尿白蛋水平，组织病理也提示系膜细胞增生情况得到缓解；体外实验证实上述exosomes可通过caspase-3途径来下调足细胞凋亡水平[31]，结果提示干细胞来源的exosomes为糖尿病肾病的治疗提供了新的思路。

exosomes与其他疾病 心肌梗死后功能性心肌细胞丢失是导致心室重塑及心力衰竭的主要原因。Exosoms作为干细胞旁分泌效应的主要组分，在促进心肌细胞增殖及血管再生方面起重要作用。研究发现，将人心脏祖细胞来源exosomes 注入动物心梗模型后，能显著降低心肌细胞的凋亡水平和促血管的生成效应[32]。随后研究相继发现，在I/R大鼠心脏中注入MSC-exosomes可显著降低心脏纤维化进展[33]。此外，exosomes还可通过血脑屏障并发挥对靶基因的表达调控。如MSC-exosomes可介导miR-146抑制神经胶质瘤的生长作用[34]。神经元也可借助exosomes转移miR-124b到星形胶质细胞，促进葡糖糖转运蛋白1的表达，调控突触活性[35]。

小结：exosomes作为生物体内的一种信息物质载体，在机体信号转导过程中扮演着重要的作用；其稳定的生物学结构，丰富的内含物和在体液中的广泛分布，使exosomes成为生命科学研究的一个重要领域，不仅可以帮助我们揭开许多疾病的发病机制，并有望使其成为新型生物标志物而被应用到临床诊断和治疗中。

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(本文编辑 加 则 青 松)

Biological function and isolation methods of exosomes

XUXiaodong,LIUZhihong

NationalClinicalResearchCenterofKidneyDiseases，JinlingHospital，NanjingUniversitySchoolofMedicine，Nanjing210016，China

Exosomes are a class of extracellular vesicles released by cells, with a size range of 40-150 nm and a lipid bilayer membrane. Exosomes contain membrane receptor, mRNA and microRNA, and may mediate specific cell-to-cell communication and activate signaling pathways in cells they fuse or interact with. With the deepening of its research in recent years, emerging evidence suggests that exosomes can be used as liquid biopsies and noninvasive biomarkers for early detection, diagnosis, and treatment of patients. However, there is no “gold standard” for the separation and purification of exosomes, which limits the research progress. This paper will review the research progress of exosomes, and the method of exosomes separation and purification in recent years．

exosomes renal disease

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2017.02.013

国家自然科学基金青年基金(81600560)；南京总医院院管课题(2016031)；江苏省科技计划项目(BE2016747)

南京军区南京总医院肾脏科 国家肾脏疾病临床医学研究中心 全军肾脏病研究所(南京，210016)

2016-12-23