三阴性乳腺癌中miRNA-124表达与E-钙黏蛋白及雄激素受体的关系

汤大北 金 艳 龚振琴 初 众 曹仲茹 张清媛

·基础研究·

三阴性乳腺癌中miRNA-124表达与E-钙黏蛋白及雄激素受体的关系

汤大北 金 艳 龚振琴 初 众 曹仲茹 张清媛

目的 研究三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer，TNBC)中miRNA-124(miR-124)的表达与E-钙黏蛋白(E-cadherin)及雄激素受体(Androgen receptor，AR)的关系。方法 采用RT-PCR在TNBC组织和癌旁正常乳腺组织中检测miR-124的表达，免疫组化检测TNBC中E-cadherin及雄激素受体(AR)的表达。结果 与癌旁正常乳腺组织相比，TNBC组织中miR-124表达明显降低(P<0.05)；TNBC组织中，miR-124表达与组织分级、E-cadherin表达有关(P<0.05)，与AR表达无关(P>0.05)。结论 在TNBC中，miR-124可能通过调节E-cadherin的表达发挥抑癌作用。

三阴性乳腺癌；miR-124；E-钙黏蛋白；雄激素受体

三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer，TNBC)是指雌激素受体(Estrogen receptor，ER)、孕激素受体(Progesterone receptor，PR)和人表皮生长因子受体(Human epidermal growth factor receptor，HER-2)均为阴性的一种特殊类型乳腺癌，约占所有乳腺癌的15%，侵袭性高，容易复发转移，预后差。抗ER、PR的内分泌治疗和抗HER-2的靶向治疗对TNBC无效，化疗作为目前唯一较为成熟的治疗方法却普遍存在副作用。因此寻找到能够准确判定TNBC预后并对其进行有效治疗的方法迫在眉睫。雄激素受体(Androgen receptor，AR)在TNBC的发生发展中起重要作用并与预后相关，可能成为TNBC靶向治疗的新选择[1]。E-钙黏蛋白(E-cadherin)是一类介导细胞间相互黏附的钙依赖性跨膜糖蛋白，参与形成和维护细胞间连结，作为上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程中的重要分子，其表达下降或缺失可造成乳腺癌的侵袭和转移。相关研究证实TNBC组织中E-cadherin及AR的表达与患者临床病理特征及预后有关[2]。目前虽然对AR和E-cadherin在TNBC中的表达情况有所研究，但二者在基因水平的调控因素尚不明确。

微小RNA(MicroRNA，miRNA)是指长度约21nt的非编码小RNA，能够在转录水平调节人体基因组内1/3以上的基因表达[4]。miRNA在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用[5-6]。miR-124是一个高度保守的抑癌miRNA，它在多种肿瘤中表达下调，与肿瘤的发生、发展以及预后密切相关。细胞学研究证实在乳腺癌中miR-124直接靶向EMT相关重要转录因子Slug，继而调节E-cadherin表达，影响乳腺癌细胞转移[3]；关于前列腺癌的研究表明，miR-124可靶向AR，抑制癌细胞生长[4]。Liang等[3]应用miRanda和TargetScan进行生物学信息预测，结果显示miR-124可以靶向人类AR及EMT相关重要转录因子Slug(又名Snail2)3′UTR区。那么在TNBC中，miR-124可否参与TNBC的发生发展，与E-cadherin和AR是否相关，值得进一步研究。本研究拟分析TNBC中miR-124表达情况及其与AR和E-cadherin之间关系。

1 材料与方法

1.1 临床标本

新鲜冰冻组织标本(肿瘤组织及癌旁正常组织)来自2011年1月—2012年8月入组的74例哈尔滨医科大学附属肿瘤医院TNBC患者。中位年龄49岁(28～70岁)。肿瘤组织学分级Ⅰ+Ⅱ级28例(37.8%)，Ⅲ级46例(62.2%)。

1.2 方法及试剂

1.2.1 免疫组化染色主要试剂及方法 抗AR兔多克隆抗体购自Abcam有限公司；抗E-cadherin兔多克隆抗体、即用型SABC(兔IgG)试剂盒和DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司；免疫组化染色采用SABC法，并按试剂盒操作；抗AR兔多克隆抗体稀释浓度1∶100；抗E-cadherin兔多克隆抗体稀释浓度1∶100。

1.2.2 结果判断 AR阳性判断标准：以细胞核中出现棕黄色颗粒或棕褐色为阳性细胞，对每片随机选取3个高倍视野，分别统计每个视野的细胞总数和阳性细胞数，之后将这3个视野的阳性细胞率取平均值得到该片的细胞阳性率。阳性细胞数<10%为阴性，≥10%为阳性[5]。E-cadherin阳性判断标准：以细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞，结果采用半定量记分法判定。按染色强度评分：无显色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；按阳性细胞的百分比评分：阳性细胞≤25%为0分，26%～50%为1分，51%～75%为2分，>75%为3分。最后以两者乘积所得分值作为判定标准：<4分者为阴性表达，≥4分者为阳性表达[6]。

1.2.3 总RNA的抽提制备及实时定量RT-PCR检测 应用mirVanaTMRNA Isolation Kit提取总RNA，步骤按试剂盒说明书执行。采用上海诺伦生物医药技术有限公司的Two Step Stemaim-it miR qRT-PCR Quantitation Kit(SYBR Green)(Cat.NO.LM-0101A)，并依照说明书完成应用BIO-RAD公司IQ5型实时定量PCR仪进行荧光定量PCR反应，反应条件：预变性95℃，3 min；变性95℃，20 s；退火及延伸62℃，40 s，重复40个循环。

1.2.4 数据处理 以U6为内参基因检测miRNA的相对表达量变化，每个标本3次RQ均值用于统计学分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-124在TNBC冰冻肿瘤组织中的表达

miR-124在TNBC组相对表达量为0.34±0.15，癌旁正常组miR-124的相对表达量为1.00±0.12。TNBC组明显低于正常对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)(图1)。

图1 miR-124在乳腺癌组织与正常组织中表达的差异性分析Figure 1 Comparison of miR-124 expression in TNBC tissues vs. PN controlsNote：*P<0.05，vs PN controls.

2.2 miR-124表达与临床病理特征的关系

miR-124表达水平与肿瘤的组织学分级有关，组织学分级越高，miR-124表达水平越低(P=0.012)。miR-124表达与年龄、肿瘤大小、淋巴结状态、临床分期、月经状态、及组织学类型无关(P>0.05)(表1)。

表1 miR-124表达与临床病理特征的关系

2.3 miR-124表达与AR、E-cadherin的关系

免疫组化法检测TNBC患者冰冻肿瘤组织中AR及E-cadherin在TNBC中表达情况。AR的阳性表达率为21.6%，E-cadherin的阳性表达率为32.4%(图2)。

在组织中，AR阳性组与阴性组miR-124表达水平无统计学差异(P>0.05)；E-cadherin阳性组miR-124表达水平高于E-cadherin阴性组，差异具有统计学意义(P=0.045)(表2)，所以miR-124表达水平与E-cadherin表达有关，与AR表达无关。

表2 miR-124与AR及E-cadherin的关系

图2 AR及E-cadherin在TNBC组织中的阳性表达(400×)Figure 2 The positive expression of AR and E-cadherin in TNBC tissue(400×)Note：A.The positive expression of AR in TNBC；B.The positive expression of E-cadherin in TNBC；C.The negative expression of AR in TNBC；D.The negative expression of E-cadherin in TNBC.

3 讨论

TNBC是乳腺癌中的特殊亚型，Lehmann等[7]通过基因集群序列表达法将TNBC分为基底细胞样1型(Basal-like 1，BL1)、基底细胞样2型(Basal-like 2，BL2)、免疫调节亚型(Immunomodulatory，IM)、间质型(Mesenchymal，M)、间质干细胞样亚型(Mesenchymal stem-like，MSL)和管腔雄激素受体亚型(Luminal androgen receptor，LAR)6种亚型。LAR亚型高表达AR DNA及AR蛋白。对比其他亚型，化疗pCR低，但对抗雄激素治疗敏感[6]。对AR信号转导通路的研究有助于TNBC诊治及预后判断。国内外研究表明[8-9]，AR在非三阴乳腺癌中的表达率超过70%，在TNBC表达为10%～50%的AR。多项研究认为AR表达与TNBC预后不良相关[9]。本研究中，AR的阳性表达率为21.6%。

E-cadherin是钙黏蛋白家族的一员，其表达水平下降可导致细胞间黏附功能丧失，肿瘤细胞容易从原发灶中脱落并发生浸润转移，是上皮间质化过程的标志。研究报道65%～73%的TNBC患者存在E-cadherin表达缺失现象[10-11]。在本研究中，有67.6%的患者E-cadherin表达阴性。在TNBC中，E-cadherin的表达意义尚无定论，但多数研究认为E-cadherin表达阴性组预后不良。既往研究结果显示E-cadherin和AR可作为TNBC预后的预测因子[2]，通过两者表达状态的联合分析，有助于评价TNBC的预后。

目前虽然对AR和E-cadherin在TNBC中的表达情况有所研究，但二者在基因水平的调节因素尚不明确。miRNA能够识别特定的目标miRNA，在转录后水平调节靶基因的表达。人类肿瘤中普遍存在miRNA的表达失调，发挥癌基因或抑癌基因的功能参与细胞增殖、凋亡和分化的调控，在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的生物学功能。在前列腺癌中，miR-124可靶向作用于AR，抑制前列腺癌细胞的生长[12]。Lv等[13]通过细胞学实验发现miR-124可以调节一系列转移相关基因进而抑制乳腺癌转移的多个步骤。MiR-124/miR-147/miR-193a-3p可共同靶向EGFR驱动的细胞周期网络蛋白进而抑制细胞周期进展和乳腺癌增殖[14]。既往研究提示miR-124在肿瘤的发生发展中具有抑癌功能，那么在TNBC中，miR-124与E-cadherin和AR是否有关，其又可否参与TNBC的发生发展值得研究。本研究首次在TNBC患者癌组织及其配对癌旁正常组织中比较miR-124的表达，RT-PCR结果显示TNBC组织miR-124的表达明显低于癌旁正常组织。MiR-124的表达与肿瘤分级呈负相关，与E-cadherin表达有关。Wang等[15]报道结直肠癌组织中miR-124比其配对癌旁正常组织的表达水平要低，并且与肿瘤组织分化程度相关；Liang等[16]报道乳腺癌组织中miR-124比其配对癌旁正常组织的表达水平低，并且与肿瘤的组织学分级及年龄呈负相关，与E-cadherin表达呈正相关；Lv等[17]在乳腺癌中未发现miR-124与E-cadherin存在相关性。本研究结果与既往研究结果相似，提示miR-124可能作为一个抑癌基因参与TNBC的发生发展。虽然Shi等[18]发现miR-124靶向作用于AR，通过抑制AR表达，上调抑癌基因p53，抑制前列腺癌细胞增殖，但本研究结果未显示TNBC组织miR-124的表达与AR表达具有相关性，这与Peters在乳腺癌细胞之中的研究结果一致[19]。这一结果提示在不同肿瘤中，同种基因可能受不同的靶基因调控，乳腺癌中miR-124与AR的关系需大样本量的体内外实验进一步研究。

综上所述，在TNBC中miR-124可能通过调节E-cadherin的表达发挥抑癌作用。然而本研究样本量有限，且未进行细胞学及动物学研究，结果仍需进行大样本量临床研究及分子生物学实验加以证实。本研究为揭示TNBC中miR-124的作用及其与AR和E-cadherin的关系提供理论依据和实验基础。

1 Pietri E，Conteduca V，Andreis D，et al.Androgen receptor signaling pathways as a target for breast cancer treatment[J].Endocr Relat Cancer，2016，23(10)：485-498.

2 Tang D，Xu S，Zhang Q，et al.The expression and clinical significance of the androgen receptor and E-cadherin in triple-negative breast cancer[J].Med Oncol，2012，29(2)：526-533.

3 Liang YJ，Wang QY，Zhou CX，et al.MiR-124 targets Slug to regulate epithelial-mesenchymal transition and metastasis of breast cancer[J].Carcinogenesis，2013，34(3)：713-722.

4 Shi XB，Xue L，Ma AH，et al.Tumor suppressive miR-124 targets androgen receptor and inhibits proliferation of prostate cancer cells[J].Oncogene，2013，32(35)：4130-4138.

5 Luo X，Shi YX，Li ZM，et al.Expression and clinical significance of androgen receptor in triple negative breast cancer[J].Chin J Cancer，2010，29(6)：585-590.

6 Kashiwagi S，Yashiro M，Takashima T，et al.Advantages of adjuvant chemotherapy for patients with triple-negative breast cancer at stage II：usefulness of prognostic markers E-cadherin and Ki67[J].Breast Cancer Res，2011，13(6)：122.

7 Lehmann BD，Jovanovic B，Xi C，et al.Refinement of triple-negative breast cancer molecular subtypes：implications for neoadjuvant chemotherapy selection[J].PLoS One，2016，11(6)：e0157368.

8 Sutton LM，Cao D，Sarode V，et al.Decreased androgen receptor expression is associated with distant metastases in patients with androgen receptor-expressing triple-negative breast carcinoma[J].Am J Clin Pathol，2012，138(4)：511-516.

9 Gasparini P，Fassan M，Cascione L，et al.Androgen receptor status is a prognostic marker in non-basal triple negative breast cancers and determines novel therapeutic options[J].PLoS One，2014，9(2)：e88525.

10 Nakagawa M，Bando Y，Nagao T，et al.Expression of p53，Ki-67，E-cadherin，N-cadherin and TOP2A in triple-negative breast cancer[J].Anticancer Res，2011，31(6)：2389-2393.

11 Kashiwagi S，Yashiro M，Takashima T，et al.Significance of E-cadherin expression in triple-negative breast cancer[J].Br J Cancer，2010，103(2)：249-255.

12 Quiros RM，Rao G，Plate J，et al.Elevated serum heparanase-1 levels in patients with pancreatic carcinoma are associated with poor survival[J].Cancer，2006，106(3)：532-540.

13 Lv XB，Jiao Y，Qing Y，et al.miR-124 suppresses multiple steps of breast cancer metastasis by targeting a cohort of pro-metastatic genes in vitro[J].Chin J Cancer，2011，30(12)：821-830.

14 Uhlmann S，Mannsperger H，Zhang JD，et al.Global microRNA level regulation of EGFR-driven cell-cycle protein network in breast cancer[J].Mol Syst Biol，2012，8：570.

15 Van Kouwenhove M，Kedde M，Agami R.MicroRNA regulation by RNA-binding proteins and its implications for cancer[J].Nat Rev Cancer 2011，11(9)：644-656.

16 Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2012[J].CA Cancer J Clin，2012，62(1)：10-29.

17 O′Day E，Lal A.MicroRNAs and their target gene networks in breast cancer[J].Breast Cancer Res，2010，12(2)：201.

18 Lewis BP，Burge CB，Bartel DP.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J].Cell，2005，120(1)：15-20.

19 Melo SA，Esteller M.Dysregulation of microRNAs in cancer：playing with fire[J].FEBS Lett，2011，585(13)：2087-2099.

(收稿：2016-10-27)

Expression of miR-124 and its relationship with E-cadherin and androgen receptor in triple-negative breast cancer

TANGDabei，JINYan，GONGZhenqin，CHUZhong，CAOZhongru，ZHANGQingyuan

Harbin Medical University Cancer Hospital，Harbin 150081，China

Objective The objective of this study was to explore the expression of miRNA-124(miR-124)and its correlation with E-cadherin and androgen receptor(AR)in triple-negative breast cancer(TNBC).Methods The expression of miR-124 was detected by RT-PCR in TNBC tissues and adjacent normal breast tissues.The expression of E-cadherin and AR in TNBC was detected by immunohistochemistry.Results The expression of miR-124 in TNBC tissues was significantly correlated with histological grade and the expression of E-cadherin(P<0.05)，and the expression of miR-124 in TNBC tissues was significantly lower than that in adjacent normal breast tissues.No correlation was found between miR-124 and AR in TNBC tissues(P>0.05).Conclusion In TNBC，miR-124 may play an anti-tumor effect by modulating the expression of E-cadherin.

Triple-negative breast cancer；miR-124；E-cadherin；Androgen receptor

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12541507)

哈尔滨医科大学附属肿瘤医院(哈尔滨 150081)

汤大北，女，(1983-)，博士，副主任医师，从事乳腺癌诊疗的研究。

张清媛，E-mail：doctortang2008@126.com

R37.9

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.02.001