卒中后抑郁大鼠血清同型半胱氨酸与叶酸水平的表达变

黄小睿 赵晓月 李雪斌 王洁

【摘要】目的觀察卒中后抑郁（PSD）大鼠血清中同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）与叶酸（Folic acid，FA）水平的表达变化。

方法将48只雄性SpragueDawley（SD）大鼠随机分成正常组、抑郁组、卒中组、PSD组，每组12只。卒中组应用线栓法制成局灶性大脑中动脉闭塞模型；抑郁组应用慢性不可测的温和刺激结合孤养法制成抑郁模型；PSD组先应用线栓法制备局灶性大脑中动脉闭塞模型，后结合慢性不可测的温和刺激及孤养法制成PSD模型。ELISA 法检测血清中Hcy与FA水平。

结果PSD组与其他各组相比较，血清中Hcy水平明显升高，而血清中FA水平则明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；抑郁组及卒中组分别与正常组相比较，血清中Hcy水平均明显升高，而FA水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；卒中组血清中FA水平明显低于抑郁组，差异有统计学意义（P<0.05）；而抑郁组与卒中组血清中Hcy水平相比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

结论卒中后抑郁大鼠模型的血清Hcy水平升高以及FA水平降低，有可能与卒中后抑郁的发病机制相关。

【关键词】卒中后抑郁；大鼠；同型半胱氨酸；叶酸

中图分类号：R749.4+1文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2017.01.003

Expression changes of Hcy and FA levels in rats models with poststroke depression

[HJ1*2][HJ]

HUANG Xiaorui1，ZHAO Xiaoyue2，LI Xuebin3▲，WANG Jie4

（1.Graduate School，2.Nephrology Department of Affiliated Southwest Hospital，3.Neurology Department of Affiliated Hospital，4.Nephrology Department of Affiliated Hospital，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China）

[HJ2][HJ]

【Abstract】ObjectiveTo explore expression changes of Homocysteine（Hcy） and Folic acid（FA） levels in rats with poststroke depression（PSD）.

Methods48 adult male SpragueDawley（SD） rats were randomly divided into normal group， depression group， stroke group and PSD group， with 12 cases in each group. Focal cerebral ischemia models established by intraluminal suture method were used in the stroke group. In the depression group， depression models were made by chronic unpredictable mild stimulation combined with separate breeding. In the PSD group， focal cerebral ischemia models established by intraluminal suture method were used at first， and then PSD rat models established by chronic unpredictable mild stimulation combined with separate breeding were applied. ELISA was used to detect the levels of Hcy and FA in serum.

ResultsCompared with the other 3 groups， serum Hcy levels in the PSD group were significantly higher， but FA levels were significantly lower， difference was statistically significant（P<0.01）. Compared with the normal group， serum Hcy levels in the depression group and the stroke group were significantly higher， but FA levels of both groups were significantly lower， difference was statistically significant（P<0.01）. The serum FA levels of the depression group was significantly higher than that of the stroke group， difference was statistically significant（P<0.05）， whereas there was no statistically significant difference between serum Hcy levels of the depression group and the stroke group（P>0.05）.

ConclusionIncrease of serum Hcy levels and decrease of serum FA levels of PSD rats models may be related with the pathogenesis of PSD.

【Key words】PSD； rats； Hcy； FA

脑卒中作为威胁我国中老年人群生命健康的常见疾病之一，目前其已成为我国排名前两位的致死病因，也是单病种致残率最高的疾病[1]。卒中后抑郁（poststroke depression，PSD）是脑卒中后的常见神经精神并发症，不仅是导致脑卒中患者生活质量降低的重要因素，同时还严重影响了患者神经功能的恢复，增加了致残率、发病率和病死率[2～3]。近年来，有研究表明高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia，HHcy）不仅是心血管疾病的独立危险因素，并且与脑卒中的发生风险密切关联[4～5]。同样，Zappacosta等[6]研究发现MTHFR基因多态性能通过影响血浆同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）水平并参与PSD的发病，提示Hcy与PSD的发生关系密切。Hcy是蛋氨酸在脱甲基后产生的一类含硫氨基酸，其代谢过程需蛋氨酸合成酶（Methionine synthase，Ms）、维生素B12（Vitamin B12，VB12）与叶酸（Folic acid，FA）等作为辅助因子。在正常生物体内Hcy的产生与代谢维持着动态平衡，在各种因素共同作用下引起的酶代谢障碍或营养物质缺乏，导致Hcy在体内积聚并最终发生HHcy。由于目前PSD的生物学发病机制尚未明确，且有关PSD大鼠模型与Hcy及FA水平间是否存在关联性的文献报道较少，因此本研究旨在探讨PSD模型大鼠血清中Hcy与FA水平的表达变化在PSD发病机制中的作用，对进一步了解PSD的发病机理及相关危险因素具有重要的意义，并期望能为PSD的预防、诊断及治疗提供新的思路和方法。

1材料与方法

1.1材料与试剂

实验动物为SPF级雄性SpragueDawley（SD）大鼠48只，体重250～300 g，由右江民族医学院动物中心（许可证号： SCXK 桂2012-0003）提供；Hcy与FA的ELISA试剂盒购自云克隆科技股份有限公司（美国进口），操作严格按照说明书进行。实验过程中对动物的处置符合右江民族医学院关于使用实验动物的伦理学标准。

1.2实验方法

1.2.1動物分组

将48只大鼠按随机数字表法分为正常组（Normal group）、抑郁组（Depression group）、卒中组（Stroke group）、PSD组（PSD group），共4组。正常组12只：置于同一笼内饲养，正常饮食、饮水；抑郁组12只：每笼1只单独饲养，采用慢性不可测的温和应激刺激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）结合孤养法制备抑郁模型；卒中组12只：采用线栓法制备局灶性大脑中动脉闭塞 （middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，制备后置于同一笼内饲养，正常饮食、饮水；PSD组12只：采用MCAO术后1周结合CUMS及孤养方法制备PSD模型。

1.2.2动物模型建立

（1）MCAO模型建立：参考Su等[7]的方法，采用插线法局灶性脑缺血/再灌注模型。（2）CUMS模型建立：参考Willner等[8]的改良方法，实验动物进行21天的CUMS处理，刺激因素包括24 h禁食禁水、4℃冰水游泳、45℃热水游泳、夹尾5 min、24 h潮湿垫料、倾斜45°、昼夜颠倒、摇晃饲养笼、24 h拥挤饲养等9种。（3）孤养法：将抑郁组和PSD组大鼠单笼饲养。各组均在相互隔离的环境下饲养。（4）模型评价：MCAO术后采用Longa[9]5分法和水平木棒实验测试脑卒中模型大鼠神经功能缺损程度；在首次CUMS后行蔗糖水消耗（Sucrose preference test）试验、旷场试验（Openfield test）等行为学试验，结合利用体重、快感、自发活动和究性活动减少程度检测大鼠抑郁症状的程度，从而证实造模是否成功。

1.2.3Hcy及FA水平检测

各组大鼠断头处死后取血，将血样品置于0℃冰上2 h，得到上层血清；血清中的Hcy及FA水平检测严格按照试剂盒所配说明书进行。

1.3统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件处理，正态分布的计量资料用（±s）表示，多组间比较采用单因素方差（OneWay ANOVA）分析，两两比较采用q检验；若不符合正态分布则采用非参数检验，检验水准：α=0.05，双侧检验。

2结果

各组Hcy、FA水平比较，与正常组、抑郁组和卒中组相比较，PSD组大鼠血清中Hcy水平明显升高，而FA水平则明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与正常组相比较，抑郁组与卒中组大鼠血清中Hcy水平均明显升高，而FA水平均明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；卒中组大鼠血清中FA水平明显低于抑郁组，差异有统计学意义（P<0.01）；而卒中组与抑郁组大鼠血清中Hcy水平相比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表1。

表1各组大鼠血清中Hcy及FA水平比较（n=12，ng/ml，±s）

组别HcyFA

正常组83.95±23.171065.20±95.85

抑郁组279.67±50.47a315.58±14.43a

卒中组252.80±50.06a217.48±9.52ab

PSD组423.22±21.27abd169.17±9.09abc

F153.76884.88

P<0.001<0.001

注：与正常组比较，aP<0.01；与抑郁组比较，bP<0.01；与卒中组比较，cP<0.05，dP<0.01。

3讨论

近年的研究报道显示，约1/3的卒中患者遭受着不同程度的卒中后抑郁及其相关症状的影响[10]。有关PSD的发生率，国外有文献[11]报道了脑卒中患者中至少有30%～60%出现过抑郁症状。而国内则有相关研究表明急性缺血性卒中患者185例中共75例患有抑郁，总的发病率为40.54%[12]。由此可见PSD不仅是脑卒中的常见并发症之一，而且发病率较高，更有可能导致卒中患者神经功能损害的进一步恶化、认知障碍的加重和更高病死率[13]。

Hcy是蛋氨酸脱甲基后产生的重要产物，它不仅参与体内的多种甲基化反应，还参与体内的能量代谢。Hcy的代谢通过蛋氨酸循环实现：Hcy由蛋氨酸合成酶（Methionine synthase，Ms）催化，5甲基四氢叶酸（5methyltetrahydrofolicacid，5MTHF）提供甲基，生成蛋氨酸和四氢叶酸（tetrahydrofolate，THF），该过程需要有辅酶FA与VB12的参与；而后蛋氨酸与ATP结合生成S腺苷蛋氨酸（Sadenosyl methionine，SAM）。SAM作为甲基供体，在甲基转移酶催化下供出甲基，变为S腺苷高半胱氨酸（Sadenosyl homocysteine，SAH），SAH最后水解再生成Hcy和腺苷。而FA既是一种水溶性B族维生素，又是生物体内重要的微量营养素。进入体内的FA主要是以5MTHF的活性形式存在，在细胞一碳单位代谢反应中起着关键作用。当Hcy蓄积过多导致HHcy时，其导致神经系统毒性作用机制可能有：（1）氧化应激反应，Hcy代谢过程中产生多种自由基，促进氧化应激的发展，并且自由基还能攻击和破坏脑血管内皮细胞及神经细胞的氧化还原信号通路，进而使得神经系统功能障碍；（2）谷氨酸受体激动反应，在HHcy状态下，由于Hcy与N甲基D天冬氨酸（NmethylDaspartate，NMDA）受体具有高亲和性[14]，故而大量Hcy与NMDA受体结合并激动NMDA产生兴奋性毒性，同时还抑制体内的甲基化反应过程，最终结果是诱导神经细胞发生凋亡；（3）神经递质合成减少，Hcy代谢过程中的辅酶，如FA的缺乏或亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR） 等关键酶基因发生突变所导致的蛋氨酸循环不能进行，Hcy在体内浓度升高而HHcy出现。若蛋氨酸循环途径发生障碍，则脑内神经中枢的甲基供体SAM生成则减少，使得單胺类神经递质如多巴胺（Dopamine，DA）、5羟色胺（5hydroxytryptamine，5HT）、去甲肾上腺素（Norepinephrine，NE）等的生成和代谢发生紊乱，而上述这些神经递质在PSD的发病中发挥着重要作用。因此，研究血清中Hcy与FA水平的表达变化在PSD发病中的作用，既有助于改善卒中患者的预后，更可为研究PSD的发病机制及治疗途径提供新思路。

HHcy是目前许多疾病发生的一个危险因素，其中也包括了多种神经系统疾病[15]。已有较多的研究报道了Hcy与帕金森病（Parkinsons disease，PD）、阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）以及认知障碍等多种神经退行性疾病的发展存在一定的联系。Narayan等[16]研究发现，HHcy能促进PD患者抑郁的发生发展，与抑郁严重程度具有相关性。Nazef等[17]研究报道了AD患者的血Hcy水平明显高于健康人群。亦有研究表明Hcy与PSD的发生关系密切，Pascoe 等[18]通过队列研究了罹患中风后1年半的瑞典老年患者，发现Hcy与患者的抑郁症状显著相关。一项来自韩国的研究则表明[19]，HHcy常见于患者发生中风后，并且与营养不良、酗酒、低血清FA水平以及维生素B12水平相关，这与本研究所得结果相一致。田丹丹等[20]通过临床对照试验发现，具有高血压病史、冠心病病史及MTHFR rs1801133位点的患者对叶酸治疗HHcy的疗效具有交互作用，表明口服叶酸治疗HHcy存在一定的依据。本研究发现，PSD组大鼠血清Hcy水平均高于正常组、抑郁组与卒中组，而FA水平均低于正常组、抑郁组及卒中组；同时，卒中组及抑郁组的血清Hcy水平均高于正常组，而FA水平均低于正常组，提示Hcy与FA在PSD的发病机制中可能发挥着重要作用。本课题组推测其机制可能是卒中病灶与抑郁障碍的共同作用导致了大鼠体内Hcy合成的增多而发生HHcy，同时辅因子FA消耗过多，加速了神经元的变性和凋亡，最终导致了PSD的发生。

综上所述，血清Hcy水平升高及血清FA水平降低可能参与了PSD发病，因此在预防、诊断及治疗PSD的过程中血清Hcy与FA水平值得关注。

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（收稿日期：2016-12-10修回日期：2017-02-07）