高效液相色谱法测定蒙药嘎古拉-5散中阿魏酸的含量

韩志广 王 栋

(1.内蒙古自治区赤峰市药品检验所，内蒙古 赤峰 024000； 2.内蒙古自治区食品药品检验研究院，内蒙古 呼和浩特 010110)

蒙药制剂嘎古拉-5散剂，主要由草果、当归、血竭、肉豆蔻、紫檀香5味药组成，具有清心热功能，用于心热引起的心慌心悸，心前区疼痛，冠心病等症的治疗[1]。当归为方中君药，具有补气活血，调经止痛，润肠通便的功效；当归是我国常用中药材，在蒙医药里使用也十分普遍，近些年研究证明，当归中的有效成分阿魏酸、当归酮、香荆芥酚等具有抑制子宫平滑肌收缩，抗血小板凝集和抗血栓，抗心肌缺血和扩张血管作用，并证明阿魏酸能改善外周循环等药理活性[2]。因此以阿魏酸作为嘎古拉-5的质量评价指标具有很好的代表性。本文为了更好地控制药品质量，采用高效液相色谱法测定嘎古拉-5中阿魏酸的含量，具有重要的实际应用价值，为进一步完善嘎古拉-5质量标准奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器：岛津高效液相色谱仪(LC10-ATVP型泵，SCL-10AVP型控制器，SPD-10AVP型检测器,SLASS-VP色谱工作站)；HR-200型万分之一天平；Presia型十万分之一天平；MAS3.6P-OCE-DM百万分之一电子天平(德国赛多利斯)。

1.2 试剂与试药： 阿魏酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110773-200611)；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂为分析纯。嘎古拉-5由内蒙古锡林郭勒盟蒙医研究所提供(批号：090215；090518；090521)；阴性样品及模拟样品由赤峰市药品检验所制备。

2 方法与结果

2.1 色谱条件： Dikma TechnologiesC18色谱柱(250mm ×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈-0.085%磷酸溶液(14：86)；柱温25℃；流速1.0 mL·min-1；进样量20 μL；检测波长316nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备： 取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中加70%甲醇制成每1mL含12μg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备： 取本品细粉(过三号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20mL，密塞，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备：按处方配制不含当归药材的样品，按2.2.2项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验：在2.1项色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20μL，注入液相色谱仪，理论板数按阿魏酸峰计应大于2000；阴性对照色谱图中，在与阿魏酸对照品以及供试品色谱相应的保留时间处无色谱峰出现，表明该方法专属性好，成方制剂中其它组分对阿魏酸的测定无干扰，见图1。

2.4 线性关系考察：精密称取阿魏酸对照品9.9mg，置50mL棕色量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取上述对照品溶液0.2mL、0.6mL、1.0mL、1.4mL、1.8 mL、2.0mL，置25mL棕色量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀，按2.1项下色谱条件测定，以浓度对峰面积进行回归分析，结果阿魏酸在1.584μg·mL-1～15.84μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。回归方程为Y=4363310.42X+6770.07，r=0.9999。

2.5 精密度试验：取批号为090215的样品制成的供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录栀子苷峰面积，计算RSD值。结果显示阿魏酸峰面积的RSD为1.15%，表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验：取批号为090215的样品制成的供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进行测定，记录阿魏酸峰面积，RSD为0.47%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.7 重复性试验：取批号为090215的样品5份，约1g，精密称定，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，测定供试品中阿魏酸含量，测得阿魏酸含量分别为0.1331 mg/g、0.1334 mg/g、0.1320 mg/g、0.1321 mg/g、0.1328 mg/g，RSD为0.46%，表明方法重复性良好。

2.8 加样回收试验：取已知阿魏酸含量的样品(批号：090215，阿魏酸含量0.1311mg/g)9份，各约0.5g，精密称定，置9个锥形瓶中，分别按已知阿魏酸含量的80%、100%、120% 3个水平精密加入阿魏酸对照品0.06mg、0.07mg、0.08mg，按2.2.2项下方法制备，测定每份样品中阿魏酸的含量，计算回收率和RSD，结果见表1。

表1 加样回收试验结果(n=3)

3 样品的含量测定

取3个批次的嘎古拉-5样品，按2.2.2项下方法处理并进样，记录阿魏酸峰面积，按外标法测定并计算样品中阿魏酸含量；为了验证生产工艺对阿魏酸含量有无影响，按处方制备模拟样品，同法计算阿魏酸含量。测定结果见表2。

表2 样品、模拟样中阿魏酸量测定结果(样品n=2，模拟样品n=3)

从表中三批样品测定的数据可见，模拟样中阿魏酸的含量为0.140mg/g，实验中用相同的方法对上述模拟样生产用当归药材进行了含量测定，测得阿魏酸含量为0.713mg/g，测定结果见表3。

表3 当归药材中阿魏酸含量测定结果(n=3)

4 结果与讨论

4.1 供试品提取条件考察： 阿魏酸为有机酸类化合物，是桂皮酸的衍生物之一，易溶于甲醇等有机溶剂，《中国药典》[3-5]多以甲醇、70%甲醇、50%甲醇为溶剂提取供试品中的阿魏酸，提取方式多为加热回流提取。本文在提取过程中，考察了以甲醇、70%甲醇、50%甲醇为提取溶剂，并考察了加热回流提取时间( 10min、20min、30min、 40min)对提取效率的影响。

实验结果表明：以70%甲醇为溶剂对阿魏酸进行提取，效果最佳，对加热回流时间的考察表明回流提取30min和回流提取40 min相比阿魏酸含量基本一致，为提高效率，将加热回流提取时间定为30 min。

4.2 色谱条件的考察： 采用高效液相色谱法测定蒙药嘎古拉-5中阿魏酸的含量多采用酸性系统，主要有甲醇-水-磷酸系统、甲醇-水-冰乙酸系统等，参照文献，经反复尝试，最终选用乙腈-0.085%磷酸溶液( 14∶86) 为流动相，分离效果好；在200nm～400nm波长范围内进行全波长扫描，结果阿魏酸在316nm处有最大吸收，故选择检测波长为316mn；实验柱温采用25℃，在此色谱条件下，阿魏酸与其他成分达到分离度良好，并具有较好的保留时间。

4.3 测定结果分析：结果表明，样品和模拟样品中阿魏酸含量相差不大，说明生产工艺对嘎古拉-5中阿魏酸含量无影响；对当归单味药材中阿魏酸的含量测定结果表明样品均一性良好，制剂工艺稳定。

本实验采用高效液相法测定嘎古拉-5中阿魏酸含量，将传统蒙医药理论与现代药学新理论、新技术有机的结合起来，进一步明确了蒙药有效成分，加强传统蒙药的现代化研究，全面控制药材质量。本方法操作简便、快捷、准确、重复性和稳定性好，适用于嘎古拉-5的质量控制，为进一步完善嘎古拉-5的质量标准奠定了基础，对促进蒙医药产业现代化、可持续发展具有重要意义。

[1]国家中医药管理局中华本草编委会．中华本草蒙药卷[M]．上海：上海科学技术出版社，2004: 274-275.

[2]杨英来,胡芳,刘小花,等. 当归补气活性部位的谱效关系研究[J]. 中草药,2013,(23):3346-3351.

[3]吕光华,程世琼,陈金泉,等. HPLC测定川芎药材和饮片中游离阿魏酸和总阿魏酸的含量及其质量评价指标[J]. 中国中药杂志,2010,(02):194-198.

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[5]金汝城,李贵文,马素丽,等. 当归中阿魏酸提取工艺的优化研究[J]. 中成药,2008,(04):516-519.