石榴皮总黄酮对高糖环境下人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用及机制

张蕾，张必嘏，郭丽萍(上海市第一人民医院宝山分院，上海00940；上海交通大学医学院附属第三医院)

石榴皮总黄酮对高糖环境下人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用及机制

张蕾1，张必嘏1，郭丽萍2
(1上海市第一人民医院宝山分院，上海200940；2上海交通大学医学院附属第三医院)

目的 探讨石榴皮总黄酮对高糖环境下人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用及机制。方法 以0、5、10、20、40、80、160 mmol/L葡萄糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤后，采用MTT法检测细胞的增殖活力。将对数生长期细胞分成空白组、模型组、阳性对照组、高浓度组、中浓度组、低浓度组。除了空白组外，其余均添加一定量葡萄糖使其终浓度为40 mmol/L，随后阳性对照组加入1×10-5mmol/L氨基胍50 μL，高、中、低浓度组分别加入1×10-4mmol/L、1×10-5mmol/L、1×10-6mmol/L石榴皮总黄酮，各50 μL，培养48 h，观察人脐静脉内皮细胞的形态， MTT法检测细胞增殖活力、碘化丙啶法检测细胞周期，并检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)、NO、超氧化物歧化酶(SOD)含量。结果 与不加葡萄糖比较，含有≥40 mmol/L葡萄糖培养基培养的人脐静脉内皮细胞吸光度值降低(P<0.05或<0.01)。与空白组比较，除高浓度组外，其余组吸光度值均降低(P<0.05或<0.01)；与模型组比较，其余组吸光度值均升高(P<0.05或<0.01)。40 mmol/L葡萄糖可使细胞周期阻滞于G0～G1期，而随着石榴皮总黄酮浓度的增加，可有效促进细胞由G0～G1期向S期转化，但对G2～M期无影响。与空白组比较，除高浓度组外，其余组细胞上清液中LDH、ICAM-1水平升高，SOD、NO水平降低(P<0.05或<0.01);与模型组比较，阳性对照组、高浓度组、中浓度组细胞上清液中LDH、ICAM-1水平降低，SOD、NO水平升高(P<0.05或<0.01)，低浓度组LDH水平降低(P<0.01)。结论 石榴皮总黄酮可明显减轻高糖环境下人脐静脉内皮细胞损伤程度，可促使细胞由G0～G1期进入S期，促进细胞增殖，机制可能与其降低黏附分子表达，提高SOD及NO水平有关。

人脐静脉内皮细胞；细胞损伤；石榴皮黄酮；高糖环境

随着人们生活方式及饮食结构改变，糖尿病及其相关血管并发症的发病率较以往显著增加。目前研究发现，血管内皮细胞功能紊乱是其主要的发病因素[1]；此外，由于大部分2型糖尿病患者长期受糖毒性、高血压等问题困扰，以至于目前的治疗效果不理想。长期服用化学药物又对患者生理及心理均造成一定负担[2]。因此，采取一种更为安全、有效的天然药物是目前研究及治疗的趋势。以往研究发现，中药提取物如杨梅素[2]、番茄红素[3]等黄酮类物质有助于减轻血管内皮细胞损伤，其他黄酮类中药提取物是否也具有相似功能值得深入研究。研究证实，石榴皮中含有大量的黄酮类物质，主要包括黄酮类、黄酮醇类、鞣质类、生物碱类、有机酸类等，其黄酮类成分在抗氧化和清除自由基能力上具有显著成效[4]，但其在糖尿病患者治疗中的应用报道较少。2016年3～7月，本文通过构建高糖诱导的内皮细胞损伤模型，并给予不同浓度石榴皮总黄酮治疗，以便更好评估其在临床治疗中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料 RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰酶、胶原酶均购自Gibco公司，DMSO、氨基胍、碘化丙啶购自Sigma公司；超氧化物歧化酶(SOD)及NO试剂盒购自南京聚力生物医学工程研究所；细胞间黏附分子1(ICAM-1)试剂盒购自ABI公司；石榴皮总黄酮实验室自制；JHBE-50 闪式提取器购自河南金鼎科技发展有限公司；ELite EsP 流式细胞仪购自Coulter公司;酶标仪购自美国BIO-RAD公司。

1.2 石榴皮总黄酮的提取 取石榴皮粉末500 g，精密称定，采用闪式提取法提取，加入10倍量的80%乙醇溶液，提取2次，每次2 min，合并两次醇提液，回收乙醇至无醇味，水溶液加入石油醚萃取2次，每次50 mL，弃去石油醚层，水溶液浓缩，干燥。参考文献[5]对石榴皮总黄酮的含量进行测定。

1.3 人脐静脉内皮细胞培养及分组 参照文献[6]方法，取健康产妇分娩时无菌条件下的胎儿脐带，以PBS冲洗残留血后，加入0.1% Ⅰ型胶原酶，37 ℃ 消化15 min，再以含有20% FBS的RPMI-1640培养基冲洗静脉，收集冲洗液，1 000 r/min离心处理5 min，弃上清液，用含有相同的完全培养基重悬细胞，接种于T25细胞培养瓶中，接种密度1×106/mL，每隔2～3 d换液1次。待细胞生长至对数生长期时，开始后续实验。

1.4 不同浓度葡萄糖作用后人脐静脉内皮细胞增殖活力的检测 采用MTT法。取对数生长期细胞，经胰酶消化后，用完全培养基重悬细胞并按1 000个/孔接种至96孔板中，添加葡萄糖使其终浓度为0、5、10、20、40、80、160 mmol/L，放入37 ℃、5% CO2环境中培养2～3 d。弃去培养液，加入 MTT(5 g/L) 20 μL，37 ℃培养4 h，加入 DMSO 100 μL缓慢振荡10 min，A490 nm波长下检测吸光度值。

1.5 石榴皮总黄酮作用后人脐静脉内皮细胞增殖活力的检测 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，将细胞分成空白组、模型组、阳性对照组、高浓度组、中浓度组、低浓度组。用完全培养基重悬细胞并按1 000个/孔接种至96孔板中，除空白组外，其余均添加一定量葡萄糖使其终浓度为40 mmol/L，随后阳性对照组加入1×10-5mmol/L氨基胍50 μL，高、中、低浓度组分别加入1×10-4mmol/L、1×10-5mmol/L、1×10-6mmol/L石榴皮总黄酮，各50 μL,然后放入37 ℃、5% CO2中培养2～3 d。在倒置相差显微镜下，观察人脐静脉内皮细胞的形态；弃去培养液，加入MTT(5 g/L)20 μL，其余步骤同1.4。

1.6 细胞周期检测 采用碘化丙啶法。以上各组细胞分别培养48 h时后，取0.25%胰酶消化，离心收集细胞，培养基重悬细胞后使各样板细胞数为1×106/L，并加入生理盐水2 mL，离心，用 D-Hank′s 200 μL重悬，加入预冷的70%乙醇固定细胞，1 500 r/min离心10 min，加入生理盐水1 mL 重悬后再次离心，加入碘化丙啶500 μL,4 ℃ 放置15 min，将待测样品加入流式细胞仪中，选择488 nm波长处检测细胞周期。每个样品含有5 000～10 000个细胞，并采用multicycle DNA分析软件处理。

1.7 人脐静脉内皮细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、SOD、ICAM-1、NO水平检测 收集培养48 h后的空白组、模型组、高浓度组、中浓度组及低浓度组细胞上清液，并参照试剂盒说明书，采用比色法在440 nm处测定吸光度值，并计算LDH释放量。采用黄嘌呤氧化酶法在550 nm测定吸光度值，并计算SOD水平。采用酶联免疫吸附法在450 nm测定吸光度值，并计算ICAM-1水平。采用比色法在550 nm测定吸光度值，并计算NO水平。

2 结果

2.1 不同浓度葡萄糖作用后人脐静脉内皮细胞的增殖活动 含0、5、10、20、40、80、160 mmol/L葡萄糖的完全培养基培养人脐静脉内皮细胞，在A490 nm测定的吸光度值分别为0.276±0.044、0.314±0.047、0.281±0.035、0.241±0.038、0.164±0.033、0.134±0.038、0.043±0.035，与不加葡萄糖比较，含有≥40 mmol/L葡萄糖培养基培养的人脐静脉内皮细胞吸光度值降低(P<0.05或<0.01)。

2.2 石榴皮总黄酮对高糖环境下脐静脉内皮细胞损伤的保护作用 空白组、模型组、阳性对照组、高浓度组、中浓度组、低浓度组吸光度值分别为0.276±0.044、0.164±0.033、0.225±0.035、0.254±0.037、0.231±0.039、0.186±0.041，与空白组比较，除高浓度组外，其余组吸光度值均降低(P<0.05或<0.01)；与模型组比较，其余组吸光度值均升高(P<0.05或<0.01)

2.3 石榴皮总黄酮对高糖所致人脐静脉内皮细胞形态学的影响 倒置相差显微镜下，空白组细胞生长状态良好，贴壁较牢，细胞间连接紧密,呈多角形或短梭形，大小均匀，边界清楚，呈单层“铺路石”样排列；模型组细胞收缩、变圆，胞体变小，细胞间隙增宽，胞核模糊，细胞边界模糊，细胞间仍彼此相连，有细胞脱落现象；阳性对照组与空白组的细胞形态无显著差别；低剂量组细胞均发生收缩、变圆、细胞间隙增宽现象；中剂量组细胞边界尚清楚，形状规则，细胞间彼此相连，很少有细胞脱落现象；高剂量组与空白组细胞形态无显著差别。

2.4 石榴皮总黄酮对人脐静脉内皮细胞细胞周期的影响 空白组、模型组、阳性对照组、高浓度组、中浓度组、低浓度组G0～G1期细胞百分比分别为47.1%、61.2%、49.5%、52.4%、56.8%，S期细胞百分比分别为27.8%、12.6%、27.6%、23.4%、18.5%，G2～M期细胞百分比分别为25.1%、26.2%、22.9%、24.2%、27.4%。各组G0～G1期及S期细胞百分比比较，P均<0.05。40 mmol/L葡萄糖可使细胞周期阻滞于G0～G1期，而随着石榴皮总黄酮浓度的增加，可有效促进细胞由G0～G1期向S期转化，但对G2～M期无影响。

2.5 各组细胞上清液中LDH、ICAM-1、SOD、NO水平比较 见表1。

表1 各组细胞上清液中LDH、SOD、ICAM-1、NO水平比较

注：与空白组对比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组对比，△P<0.05，△△P<0.01。

3 讨论

血管内皮细胞是覆盖在血管内膜表面，并参与血液循环的一类重要细胞。其通过释放生物活性物质，如NO等调节血管收缩及舒张，通过调控细胞间黏附分子如ICAM-1的表达等来调控炎症的发生[6,7]；一旦内皮细胞出现损伤，即可引起ICAM-1等分子的高表达，而后者对白细胞具有极强的吸附作用。当白细胞黏附于血管壁时将引起自由基以及炎症细胞因子释放，并进一步加剧内皮细胞损伤。石榴皮药用价值极高，其中含有的有效成分之一即是黄酮类物质。研究[8]证实,黄酮类物质具有抗细胞凋亡、抗氧化及消除氧自由基作用，且长期服用含黄酮类物质可改善内皮功能，降低血压。但以往对于石榴皮总黄酮作用主要集中在缺氧所致的内皮细胞损伤模型中，缺少高糖引起的内皮细胞损伤模型。

本研究发现，人脐静脉内皮细胞在40 mmol/L葡萄糖浓度下即可出现细胞损伤，同时在该浓度下对细胞渗透压影响较小，且基本与文献[9]报道相符，因此，本研究采用此浓度葡萄糖构建内皮细胞损伤模型。结果显示，40 mmol/L葡萄糖对于细胞增殖具有明显抑制作用，且细胞大多数处于G0～G1期。细胞周期中存在两个限制点，分别为G0～G1期及G2～M期，当细胞增殖过程中出现DNA或纺垂体损失时，可使细胞停滞于以上两期并进行适当修复，由此可见，高糖可能对细胞DNA造成损伤。研究发现，高糖环境下DNA链断裂概率较高，且诱导细胞凋亡的发生[10]，但目前对于其详细的致病机制及调控因素仍处于探索阶段。本研究结果显示，40 mmol/L葡萄糖可使细胞周期阻滞于G0～G1期，而随着石榴皮总黄酮浓度的增加，可有效促进细胞由G0～G1期向S期转化。与空白组比较，除高浓度组外，其余组吸光度值均降低；与模型组比较，其余组吸光度值均升高。提示石榴皮总黄酮可减轻人脐静脉内皮细胞损伤程度，改善其细胞周期分布。

LDH 是内皮细胞损伤后的代谢产物，直接反映内皮细胞损伤的程度。本文结果显示，高糖环境诱发细胞LDH升高，而石榴皮总黄酮抑制LDH 的释放，减轻内皮细胞损伤。由于氧化应激反应是细胞内皮损伤的重要因素之一，而活性氧的相对含量增加对于促进糖尿病相关并发症的发展具有直接作用。因此，提高SOD水平可有效清除超氧阴离子，从而起到保护作用。本研究结果证实，提高石榴皮总黄酮给药剂量对于提高SOD水平有帮助。此外，NO作为血管扩张剂，其本身是活泼自由基，可与超氧阴离子快速结合生产过氧亚硝，而SOD高活性在减少超氧阴子浓度的同时，可使NO含量提高，从而增强舒张血管的作用。谢奇等[11]研究发现，石榴皮总黄酮提取物可缓解大鼠心衰症状，其作用机制可能是由于石榴皮总黄酮提高血管内SOD含量从而强化抗氧化作用，并通过内皮途经提高NO含量、抑制钙内流。此外，细胞间黏附分子表达量的减少，对于改善内皮损伤也具有作用。以往研究[12～14]发现，减少ICAM-1表达量可使白细胞更难吸附于内皮细胞，从而减少自由基释放及脱颗粒途经的启动，从而避免了内皮细胞损伤进入恶性循环。本研究结果显示，石榴皮总黄酮可使人脐静脉内皮细胞ICAM-1含量降低，与文献报道一致。提示其可能通过减少黏附因子表达，提高SOD及NO水平而减轻人脐静脉内皮细胞损伤。

综上所述，石榴皮总黄酮可明显减轻高糖所致的人脐静脉内皮细胞损伤，可促使细胞由G0～G1期进入S期，促进细胞增殖，减少黏附分子表达，提高SOD及NO水平，且改善程度具有明显的剂量依赖性。

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Protective effect of total flavonoids of Pomegranate husk on injuries of human umbilical vein endothelial cells under high glucose

ZHANGLei1,ZHANGBixia,GUOLiping

(1BaoshanBranchofShanghaiFirstPeople'sHospital,Shanghai200940,China)

Objective To investigate the protective effect of total flavonoids of Pomegranate husk on injuries of human umbilical vein endothelial cells under high glucose.Methods The injuries of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were induced by 0, 5, 10, 20, 40, 80 and 160 mmol/L glucose. MTT was used to detect the cell viability. The cells in the logarithmic phase were divided into the blank group, model group, positive control group, high concentration group, medium concentration group and low concentration group. In addition to the blank group, cells in the rest of the groups were added with a certain amount of glucose to the final concentration of 40 mmol/L, followed by the positive control group with 1×10-5mmol/L aminoguanidine 50 μL, high, medium and low concentration groups with 1×10-4, 1×10-5and 1×10-6mmol/L total flavonoids of Pomegranate husk (50 μL in each group), and they were all cultured for 48 h. We observed the morphology of human umbilical vein endothelial cells. MTT assay was used to detect cell viability. The cell clyce, the levels of lactate dehydrogenase (LDH), intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), NO and superoxide dismutase (SOD) were measured by the propidium iodide method.Results The optical density (OD) of HUVECs treated with glucose (≥40 mmol/L) was decreased as compared with that of HUVECs without adding glucose (P<0.05 orP<0.01). Compared with the blank group, in addition to high concentration group, the OD in the other groups was decreased (P<0.05 orP<0.01). Compared with the model group, the OD of the other groups was increased (P<0.05 orP<0.01). Forty mmol/L glucose caused cell cycle arrest in G0-G1phase, and with the increase of flavonoids from Pomegranate husk, it effectively promoted the cell transformation from G0-G1 to S phase, but it had little effect on cells in the G2-M phase. Compared with the blank group, the levels of LDH and ICAM-1 were higher in the supernatant of the other groups except in the high concentration group, and the levels of SOD and NO were decreased. Compared with the model group, the levels of LDH and ICAM-1 in the supernatant of the positive control group, the high concentration group and the medium concentration group were decreased, the levels of SOD and NO were increased (P<0.05 orP<0.01), and the LDH level in the low concentration group was decreased (P<0.01).Conclusion Flavonoids from Pomegranate husk can significantly reduce the injuries of HUVECs under high glucose, promote the cell from G0-G1to S phase, and promote cell proliferation, which may be related with the reduction of expression of adhesion molecules, and the increase of SOD and NO.

human umbilical vein endothelial; cell injuries; flavonoids from Pomegranate husk; under high glucose

上海市卫生和计划生育委员会科研课题(20144Y0235)。

张蕾(1980-)，女，主治医师，从事糖尿病肾病的临床研究。E-mail：yynn150@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.008

R151.4

A

1002-266X(2017)13-0028-04

2017-01-11)