TRAIL逆转人胃腺癌SGC7901/ADR细胞多药耐药的机制探讨

孙海兵，张开光，李琴，刘应玲，陈思(安徽医科大学附属省立医院，合肥230001)

TRAIL逆转人胃腺癌SGC7901/ADR细胞多药耐药的机制探讨

孙海兵，张开光，李琴，刘应玲，陈思
(安徽医科大学附属省立医院，合肥230001)

目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对人胃腺癌阿霉素耐药细胞(SGC7901/ADR细胞)多药耐药基因(MDR1)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)、抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax表达的影响，以明确TRAIL逆转胃癌多药耐药的可能机制。方法 MTT法检测SGC7901/ADR细胞和其亲本细胞SGC7901对阿霉素、长春新碱、顺铂的药物敏感性。实时荧光定量PCR法检测SGC7901/ADR细胞和SGC7901细胞 MDR1、MRP1、Bcl-2、Bax mRNA表达。不同浓度(10、50、100 ng/mL)TRAIL处理SGC7901/ADR细胞后，使用实时荧光定量PCR法、蛋白印迹法检测各处理细胞和空白对照(未加TRAIL)细胞MDR1、MRP、Bcl-2、Bax mRNA及蛋白的表达。结果 药物敏感试验显示，与亲本细胞SGC7901相比，长春新碱、阿霉素、顺铂对SGC7901/ADR细胞的IC50明显提高(P<0.01或<0.05)。SGC7901/ADR细胞中MDR1、MRP1、Bcl-2的 mRNA表达量与亲本细胞SGC7901相比上升，Bax mRNA表达量降低(P均<0.01)。TRAIL处理细胞后，下调了SGC7901/ADR细胞的MDR1、MRP1、Bcl-2 mRNA和蛋白的相对表达量，提高了Bax mRNA相对表达量，与空白对照相比，差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论 TRAIL可能通过下调MDR1、MRP1、 Bcl-2和上调Bax的表达促进胃癌耐药细胞的凋亡，进而部分逆转胃癌的多药耐药。

胃肿瘤；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；多药耐药；细胞凋亡

胃癌是全球第五大最常见恶性肿瘤，也是癌症死亡的第三大原因[1]。超过70%的胃癌病例发生在发展中国家[1]。在胃癌治疗中，化疗仍是非常重要的疗法，但多药耐药(MDR)现象的产生常致使化疗失败。MDR的发展通常由一种或多种能量依赖性转运蛋白介导，这种转运蛋白可从细胞中发现并排出抗癌药物[2]。这些转运体包括P糖蛋白(P-gp)、多药耐药基因(MDR1)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)、肺癌耐药蛋白和乳腺癌耐药蛋白。除此之外，其他的机制也参与了肿瘤获得性耐药的发展，包括对药物诱导凋亡的不敏感性[3]。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是一个能高度选择性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无损害的肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员之一。TRAIL可以提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用，同时对肿瘤耐药细胞也有较强的致凋亡作用，并可以将肿瘤耐药细胞株逆转为敏感细胞株[4]。研究表明，降低肿瘤细胞MDR1、MRP1表达，以及上调Bax/Bcl-2，可提高肿瘤对化疗药物的敏感性[5,6]，但TRAIL可否通过影响MDR1、MRP1和Bax/Bcl-2基因的表达而增加肿瘤对化疗药物的敏感性尚不明确。2016年3～12月，我们观察了TRAIL对SGC7901/ADR 细胞中MDR1、MRP1、Bcl-2和Bax 表达的影响，旨在探讨TRAIL杀伤肿瘤耐药细胞及增加化疗药物敏感性的可能机制，为胃癌化疗寻找新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃腺癌耐药细胞株SGC7901/阿霉素(ADR)和亲本细胞株SGC7901由第四军医大学西京医院全军消化病研究所樊代明教授惠赠。PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成，TRAIL蛋白购于Peprotech公司(美国)，TRIzol试剂购于Invitrogen公司(美国)，MTT购于Sigma公司(美国)，First Strand cDNA Synthesis Kit 购于Thermo公司(美国)，QuantiFast SYBR Green PCR Kit 购于Qiagen公司(德国)；小鼠抗人单克隆抗体MDR1、MRP1、Bcl-2购于圣克鲁斯生物技术公司(美国)，兔抗人β-actin多克隆抗体购于BioWorld 公司(美国)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG购于北京中杉金桥生物技术有限公司。长春新碱(VCR)购于深圳万乐药业有限公司，顺铂(DDP)注射液购于南京制药有限公司, ADR购于山西普德药业股份有限公司。

1.2 细胞培养 SGC7901细胞采用含10%胎牛血清，青霉素、链霉素各100 U/mL的RPMI1640培养液培养。人胃腺癌耐药株SGC7901/ADR在上述培养液的基础上加入终质量浓度为1 μg/mL的ADR维持其耐药性，于实验前2周去掉ADR培养。在恒温37 ℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度的培养箱中进行培养。

1.3 药物敏感性试验 采用MTT法。取处于对数生长期的SGC7901细胞和SGC7901/ADR细胞，以每孔1×104的细胞数接种于96孔板中，细胞贴壁后分别加不同浓度的ADR(SGC7901细胞的药物浓度为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μg/mL，SGC7901/ADR细胞的药物浓度为0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL)、DDP(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL)、VCR(4、8、16、32、64、128、256 μg/mL)含药培养液,常规培养48 h后每孔加入MTT 20 μL,接着孵育4 h,去除上清液，每孔加入150 μL DMSO,低速振荡10 min,在免疫酶标仪波长490 nm处检测各孔的吸光度(A)值。根据A值，计算出相应药物的半数抑制浓度(IC50)。实验重复3次。

1.4 SGC7901和SGC7901/ADR细胞中MDR1、MRP1、Bcl-2、Bax mRNA相对表达检测 采用实时荧光定量PCR法。收集处于对数期的SGC7901和SGC7901/ADR细胞，采用TRIzol试剂提取总RNA，具体实验步骤根据试剂盒的操作说明进行。各组的总RNA浓度和纯度用分光光度仪测定。取2 μg总RNA，按照FirstStrand cDNA Synthesisi Kit试剂盒的操作步骤，在PCR仪上将其逆转为cDNA。MDR1上游引物：5′-GGAAGCCAATGCCTATGACT-3′,下游引物5′-GAACCACTGCTTCGCTTTCT-3′；MRP1上游引物5′-GATTCAGCCACAGGAGGTAGAGAGCA-3′，下游引物5′-ACTTCCACATCTGCTTCGTCAGTGG-3′；Bcl-2上游引物5′-GGATTGTGGCCTTCTTTGAG-3′,下游引物5′-TACCCAGCCTCCGTTATCCT-3′；Bax上游引物5′-CCGATTCATCTACCCTGCTG-3′，下游引物5′-TGAGCAATTCCAGAGGCAGT-3′；β-actin上游引物5′-TTGCCGACAGGATGCAGAAGG-3′,下游引物5′-GCCGATCCACACGGAGTACTT-3′。以β-actin为内参照，使用QuantiFast SYBRGreen PCR Kit试剂盒，在ABI7500qPCR仪上进行扩增，反转录反应条件为42 ℃、1 h，70 ℃、5 min，4 ℃、10 min。PCR 扩增条件为95 ℃、5 min，95 ℃、10 s,60 ℃、34 s，共40个循环。采用2-ΔΔCT法计算基因相对表达量。

1.5 TRAIL作用后SGC7901和SGC7901/ADR细胞中MDR1、MRP1、Bcl-2、Bax mRNA相对表达检测 采用实时荧光定量PCR法。收集处于对数期的SGC7901/ADR细胞，每孔2×105个细胞接种于六孔板中，细胞贴壁生长后，弃掉培养液，在SGC7901/ADR细胞中加入含有终质量浓度为10、50和100 ng/mL TRAIL的培养液，同时设置对照孔(未经TRAIL处理的SGC7901/ADR细胞)。加入TRAIL 48 h以后，收集上述各组处理细胞，然后参照1.4所述PCR方法进行操作。

1.6 TRAIL作用后SGC7901/ADR细胞中MDR1、MRP1、Bcl-2蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集处于对数期的SGC7901/ADR细胞，以每孔2×105个细胞接种在六孔板中，细胞贴壁生长后加入10、50、100 ng/mL TRAIL,并设空白对照。加入TRAIL 48 h后，使用预冷的PBS洗涤细胞2次以后，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min,收集，离心，取上清，用二辛可酸法测定蛋白的浓度，并且与上样缓冲液4∶1混合，100 ℃煮沸，得到蛋白样品可进行试验或-80 ℃保存以备用。将样品用12.5% SDS-PAGE 分离蛋白，电泳以后将蛋白转移至PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶封闭，洗膜后在一抗稀释液中，4 ℃反应过夜。洗膜后加入二抗[山羊抗鼠IgG(抗体稀释比例为1∶50 000)]，室温孵育2 h，再次洗膜后，加入ECL进行显影。采用GE 公司(美国)的Image Quant LAS4000 数字成像系统显影。用Quantity One 软件分析目的蛋白和相对应的内参蛋白条带灰度值。将空白对照设为1，计算出各处理细胞与空白对照的相对比值。β-actin用作内参照。

2 结果

2.1 体外药物敏感性试验结果 ADR、DDP、VCR对SGC7901的IC50分别为(0.531±0.028)、(0.656±0.050)、(4.487±0.303)μg/mL，对SGC7901/ADR细胞的IC50分别为(10.910±0.642)、(0.920±0.095)、(60.719±1.258)μg/mL；与SGC7901细胞相比，VCR、ADR、DDP对SGC7901/ADR细胞的IC50升高(P<0.01或<0.05)。

2.2 SGC7901/ADR细胞与SGC7901细胞MDR1、MRP1、Bcl-2、Bax mRNA相对表达量的比较 SGC7901/ADR细胞MDR1、MRP1、Bcl-2、Bax mRNA的相对表达量分别为1.105±0.064、1.010±0.053、0.999±0.080、1.000±0.061，SGC7901细胞MDR1、MRP1、Bcl-2、Bax mRNA的相对表达量分别为5 157.056±542.403、126.676±4.714、6.798±0.454、0.100±0.016。与SGC7901细胞相比，SGC7901/ADR细胞中MDR1、MRP1、Bcl-2 mRNA相对表达量增加(P均<0.01)，Bax mRNA相对表达量下降(P均<0.01)。

2.3 TRAIL对SGC7901/ADR细胞MDR1、MRP1、Bcl-2 mRNA相对表达量的影响 见表1。不同浓度TRAIL(10、50、100 ng/mL)作用细胞48 h后，与未加TRAIL处理的空白对照相比，MDR1、MRP1、Bcl-2 mRNA相对表达量降低(P均<0.01),Bax mRNA相对表达量增高(P<0.01)。

表1 TRAIL对SGC7901/ADR细胞中MDR1、MRP1、Bcl-2、Bax mRNA相对表达量的影响

注：与空白对照相比，aP<0.01。

2.4 TRAIL对SGC7901/ADR细胞MDR1、MRP1、Bcl-2蛋白表达量的影响 见表2。不同浓度TRAIL(10、50、100 ng/mL)作用细胞48 h后，与未经TRAIL处理的空白对照相比，MDR1、MRP1、Bcl-2蛋白表达量降低(P<0.05或<0.01)。

表2 TRAIL对SGC7901/ADR细胞中MDR1、MRP1、Bcl-2蛋白表达量的影响

注：与空白对照相比，#P<0.05,##P<0.01。

3 讨论

化疗在胃癌的治疗中起着重要作用，然而MDR现象的产生是化疗失败的重要原因，因而制约了化疗药物在临床的使用。MDR涉及大量和复杂的分子机制，包括增加药物外排、细胞内药物累积的再分布、药物解毒作用的增加或者改变药物靶分子、增强DNA损伤修复、抑制药物诱导的凋亡等[7～9]。耐药基因的激活和表达增加已经被证明与肿瘤的耐药性有关。MDR1[10]和MRP1[11]已经被发现在调节胃癌的MDR中起着重要作用。与MDR1一样，MRP1也属于ATP合盒超家族，在MDR的发展中起着重要的作用。当肿瘤细胞高表达P-gp和MRP1时，许多化疗药物被从肿瘤细胞中排出。P-gp是第1个被发现的ABC转运蛋白，由两个跨膜结构域组成，每个跨膜结构域包含具有两个细胞质核苷酸结合域的6个跨膜片段和1个磷酸腺苷共有基序。MRP1是第2个被发现的并且与P-gp具有相似结构域组织的ABC转运蛋白，氨基酸的相似性仅限于两个保守的ATP结合结构域[12]。本研究结果表明，与亲本细胞SGC7901相比，SGC7901/ADR细胞中MDR1、MRP1的转录水平明显增加，提示SGC7901/ADR细胞的耐药性可能与MDR1、MRP1的高表达有关。

TRAIL是一个能高度选择性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无明显损害的TNF超家族成员之一，这一特征使其在肿瘤治疗方面有良好的应用前景。TRAIL对MDR细胞也有较强的致凋亡效应，可以增加MDR细胞对相关化疗药物的敏感性[4]。有研究表明，降低肿瘤MDR1、MRP1的表达可以增强肿瘤对化疗药物的敏感性[12]。有研究发现，TRAIL可以通过下调P-gp的表达来增加化疗药物对人白血病耐药细胞株CEM/VBL的细胞毒作用[4]。本研究发现，TRAIL明显下调了胃癌耐药细胞SGC7901/ADR中MDR1、MRP1转录和翻译水平的表达,表明TRAIL可能通过抑制MDR1、MRP1的表达进而逆转胃癌MDR。

提高抗凋亡能力也是MDR的一种重要的机制。有研究表明Shugoshin1可通过抑制胃癌细胞的凋亡进而促进MDR表型的形成[13]。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是两个重要的内源性凋亡途径的调控因子，有报道[6]指出Bcl-2可以在体内与Bax竞争并形成Bcl-2/Bax异源二聚体。Bax的同二聚体(Bax/Bax)在外膜中产生大孔，并通过促进细胞色素C的释放进而促进凋亡，而Bcl-2/Bax的异源二聚体防止孔形成并抑制细胞凋亡,即Bcl-2/Bax降低，可以导致肿瘤细胞凋亡,相反，Bcl-2/Bax升高能够抑制肿瘤细胞细胞凋亡，降低对药物的敏感性。本研究结果发现，与亲本细胞SGC7901相比，SGC7901/ADR细胞中Bcl-2 在转录水平上表达升高，Bax则表达下降，说明SGC7901/ADR细胞中Bcl-2/Bax明显增高，进而抑制细胞凋亡，因而可能参与MDR的发展。在胃癌耐药细胞SGC7901/ADR中，使用TRAIL处理后，发现在转录和翻译水平上TRAIL明显下调了Bcl-2的表达，在转录水平上TRAIL上调了Bax基因的表达。表明TRAIL可能通过抑制Bcl-2和提高Bax的表达，即降低Bcl-2/Bax值，进而促进对胃癌耐药细胞的致凋亡作用，从而逆转胃癌MDR。

总之，TRAIL可能是通过下调耐药基因MDR1、MRP1和抗凋亡基因Bcl-2的表达，以及增加促凋亡基因Bax的表达，增强了对肿瘤耐药细胞的致凋亡作用，进而部分逆转胃癌的MDR。TRAIL通过什么途径下调胃癌耐药细胞内MDR1、MRP1、Bcl-2表达以及上调Bax基因表达有待于下一步探讨。

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Mechanism of TRAIL reversing multidrug resistance of human gastric adenocarcinoma SGC7901/ADR cells

SUNHaibing,ZHANGKaiguang,LIQin,LIUYingling,CHENSi

(AnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China)

Objective To investigate the influence of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) on multidrug resistance gene (MDR1), multidrug resistance-associated protein (MRP1), anti-apoptotic gene Bcl-2 and pro-apoptotic gene Bax in human gastric cancer SGC7901/ADR cells and to explore the possible mechanism of TRAIL reversing multidrug resistance of gastric cancer. Methods The drug sensitivity of SGC7901/ADR cells and their parent cells SGC7901 to doxorubicin, vincristine and cisplatin was detected by MTT assay. The mRNA expression of MDR1, MRP1, Bcl-2, Bax gene of SGC7901/ADR and SGC7901 cells was detected by real-time fluorescence quantification PCR. SGC7901/ADR cells were treated with different concentrations of TRAIL (10, 50, 100 ng/mL). The real-time fluorescence quantification PCR and Western blotting were used to measure the expression of MDR1, MRP1, Bcl-2, Bax mRNA and protein of various genes in different treatment groups and the blank control group.Results MTT assay for drug sensitivity test showed that, compared with SGC7901 cells, the IC50of SGC7901/ADR cells to doxorubicin, vincristine and sisplatin was significantly increased (P<0.01 orP<0.05). Compared with SGC7901, the expression levels of MDR1, MRP1, Bcl-2 mRNA in SGC7901/ADR cells were significantly increased, but the expression of Bax mRNA was decreased (allP<0.01). The mRNA and protein expression levels of MDR1, MRP1 and Bcl-2 in SGC7901/ADR cells were down-regulated by TRAIL, and the expression of pro-apoptotic protein Bax mRNA was up-regulated. Compared with the blank control group, there were statistically significant differences (allP<0.05).Conclusion TRAIL may down-regulate the expression of MDR1, MRP1, Bcl-2 and up-regulate the expression of Bax to promote the apoptosis of gastric cancer drug-resistant cells, and reverse multidrug resistance of gastric cancer drug-resistant cells.

stomach neoplasms; tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand; multidrug resistance; apoptosis

安徽省自然科学基金资助项目(1308085MH167)。

孙海兵(1992-)，男，硕士研究生，主要研究方向为胃癌耐药机制探讨。E-mail:sunhaibing9205@126.com

张开光(1966-)，男，教授，主要研究方向为胃肠道疾病的内镜诊治及胃癌耐药机制探讨。E-mail: zhangkaiguang0097@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.003

R735.2

A

1002-266X(2017)13-0009-04

2017-02-08)