高效液相色谱法测定酶法制备L-色氨酸

陈 军， 徐礼生， 张兴桃， 董 增

（宿州学院 生物与食品工程学院，安徽 宿州234000）

高效液相色谱法测定酶法制备L-色氨酸

陈 军， 徐礼生， 张兴桃， 董 增

（宿州学院 生物与食品工程学院，安徽 宿州234000）

研究了高效液相色谱法测定酶法制备L-色氨酸的最佳参数。结果表明，流动相分配比V（磷酸二氢钾溶液）∶V（甲醇）=30∶70，流量1 mL/min，C18柱分离，柱温38℃，检测波长265 nm时为高效液相色谱法检测L-色氨酸的最佳参数。回收率在92.00%～110.00%，外加丝氨酸没有干扰发酵液中L-色氨酸含量测定。此方法用于样品中的L-色氨酸的测定，分离效果良好。

高效液相色谱；L-色氨酸；酶法制备

L-色氨酸在人体是一种限制性氨基酸，也是一种必需氨基酸，在人体内无法合成，需要从食物中摄取。作为食品添加剂[1]，早期L-色氨酸的生产多采用化学合成法、蛋白质水解法等，由于酶法制备色氨酸具有成本低、周期短、产率高、质量好等优点，因此该技术将会成为L-色氨酸的工业化生产的主要方法。目前，L-色氨酸测定方法有氨基酸分析仪 、分光光度法和荧光法等[2-9]，鉴于高效液相色谱技术具有分辨率高、速度快、重复性高等优点，高效液相色谱法测定微生物发酵液中的L-色氨酸已有报道[10-11]，但高效液相色谱法用于酶法制备L-色氨酸的测定尚未见报道。作者通过考察流动相及其分配比、波长、柱温等因素，确立了高效液相色谱法测定酶法制备L-色氨酸的最适色谱条件，并进行了方法评价。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

丝氨酸，甲醇，L-色氨酸，磷酸二氢钾，氢氧化钠，双蒸水：以上试剂均为分析纯。

岛津LC-20AT型高效液相色谱仪：日本岛津公司；KQ5200DB数控超声波清洗器；80-2型电动离心机：金城国盛实验仪器厂；PHS-3C型精密酸度计。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件确定方法 利用岛津LC-20AT型高效液相色谱仪测定L-色氨酸的含量，采用0.025%磷酸溶液-甲醇体系作为流动相，分别研究流动相及分配比、流动相流速、检测波长及柱温对检测结果的影响。

1.2.2 标准曲线 称取L-色氨酸0.400 g定容1 L，配置成质量浓度为400 mg/L的L-色氨酸标准样品，将上述配置好的L-色氨酸标准样品用流动相稀释成一定的浓度梯度，将所有标准样品采用0.30 μm微孔滤膜过滤后采用UV-紫外分光光度法检测，绘制L-色氨酸标准样品。

1.2.3 发酵液样品的处理 取1.0 mL发酵液15 000 r/min离心5 min，然后用移液枪吸取其上清液，进行适当稀释，使其质量浓度介于0～400 mg/L的线性范围内，然后用0.30 μm微孔滤膜过滤，所得滤液采用UV-紫外分光光度法[12]测定其L-色氨酸含量。

2 结果与分析

2.1 流动相及分配比的确定

设置分配比为20∶80、25∶75、30∶70、35∶65、40∶60五个体系，由图1可知，随着增大流动相分配比，其波峰面积呈现先增大后降低趋势，分配比流动相为30∶70的条件下，波峰面积具有最大值，综上分析选用V（0.025%磷酸溶液）∶V（甲醇）=30∶70为该方法测定酶法制备L-色氨酸的最佳分配比流动相。

2.2 流动相流速的确定

分别选择流动相的总流速为0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min，观察发酵液的波峰变化和高效液相色谱仪的压力变化。结果表明，流速越小其保留时间越大，波峰的分离效果较好；流速越大其保留时间越小，但发酵液中物质的分离效果变差。另外流速越大其泵压也增大，易损坏分离柱，该法测定酶法制备L-色氨酸研究的最适流速为1.0 mL/min。

图1 不同流动相分配比下L-色氨酸的检测波峰面积Fig.1 Peak area of L-tryptophan under different mobile phase

2.3 检测波长的确定

L-色氨酸含有一个苯环，紫外线区域内有吸收峰，测定中不需添加其它显色试剂。为了探讨最适检测波长，在工作站中设置5个检测器波长，分别为245、255、265、275、285 nm。由图2可知，随着波长提高，其波峰面积呈现先增大后降低趋势，波长设定为265 nm时，波峰具有最大值。确定检测波长在265 nm时为高效液相色谱法测定酶法制备L-色氨酸研究的最佳波长。

图2 不同紫外波长下L-色氨酸的检测波峰面积Fig.2 Peak area of L-tryptophan under different ultraviolet wavelengths

2.4 柱温的确定

柱温对高效液相色谱法测定酶法制备L-色氨酸有较大影响，选择一个合适的柱温对检测结果至关重要，柱温分别设置30、35、40、45、50℃。由图3知，随着柱温的提高，其波峰面积呈现先增大后减小的趋势，其中柱温在38℃时，L-色氨酸出现一个最大吸收峰面积，当柱温继续升高时，L-色氨酸的波峰面积逐渐降低。综上讨论，最终确定柱温38℃为高效液相色谱法测定酶法制备L-色氨酸研究的最优柱温。

图3 不同柱温条件下L-色氨酸的检测波峰面积Fig.3 Peak area of L-tryptophan at different column temperature

2.5 确定色谱条件及标准曲线的确定

以岛津 C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）为分离柱，流动相分配比为V（0.025%磷酸溶液）∶V（甲醇）=30∶70，流速为1.0 mL/min，柱温为38℃，检测波长为265 nm，进样量为10 μL，图4所示为L-色氨酸标准品使用该法检测的色谱图，L-色氨酸的保留时间为3.520 min。

根据以上色谱条件，得L-色氨酸的标准曲线，见图5，可知线性范围在0～400 mg/L内，线性相关系数为R2=0.999 3，线性关系良好。

图4 L-色氨酸标准样品色谱图Fig.4 Chromatograms of L-tryptophan standard sample

图5 L-色氨酸标准曲线Fig.5 Standard curves of L-tryptophan

2.6 加样回收率测定

为了进一步验证其准确性，进行了回收实验检测，取质量浓度为200 mg/L的L-色氨酸标准品100 mL，然后取100 mg的L-色氨酸样品加入到已知的200 mg/L L-色氨酸标准品中混合，将其混合液进行进样检测，在相同条件检测5次，结果见表1。结果表明，回收效果良好，回收率在92.00%～110.00%，平均值99%，由此可见，高效液相色谱法测定酶法制备L-色氨酸准确度较好。

表1 L-色氨酸加样回收率测定（n=5）Table 1 Recovery test of L-tryptophan（n=5）

2.7 干扰试验

本实验中的L-色氨酸发酵液是通过丝氨酸经过酶催化转换而成的，而检测结果证实了发酵液中含有剩余的丝氨酸，为了排除丝氨酸的影响，进行了标准品加入丝氨酸的干扰实验。取100 mg/L丝氨酸1 mL与100 mg/L L-色氨酸等体积混合，将其混合液用高效液相色谱法进行测定，结果见图6。色谱图中只有L-色氨酸波峰，且其保留时间为3.520 min，这与L-色氨酸标准品的保留时间基本相同，可见在265 nm检测波长下丝氨酸对L-色氨酸的检测没有影响，所以外加丝氨酸没有干扰发酵液L-色氨酸质量浓度的测定。

图6 混合液色氨酸与丝氨酸的色谱图Fig.6 Chromatograms of mixed liquor of L-tryptophan and serine

2.8 样品的测定

采用流动相分配比V（磷酸二氢钾溶液）∶V（甲醇）=30∶70，流量1 mL/min，柱温38℃，检测波长265 nm测定L-色氨酸合成酶发酵液，得出L-色氨酸色谱图。由图7可知，色谱柱柱效高，将波峰面积代入标准曲线中，得出发酵液中L-色氨酸质量浓度为80mg/L。

图7 样品中L-色氨酸检测色谱图Fig.7 Results of L-Tryptophan of the sample

3 结语

通过研究确立了高效液相色谱法测定酶法制备L-色氨酸的最适色谱条件，流动相分配比V（磷酸二氢钾溶液）∶V（甲醇）=30∶70，流量1 mL/min，C18柱分离，柱温38℃，检测波长265 nm。方法用于发酵液中的L-色氨酸的测定，保留时间为3.520 min，在0～400 mg/L范围内线性良好，回收率在92%～110%之间，外加丝氨酸没有干扰发酵液中L-色氨酸含量测定。该方法简便、准确、适用性强。

[1]LI Jianxin，ZHANG Xumei，XU Qishou.Physiological and biochemical effects of tryptophan and its application[J].Amino Acids＆Biotic Resources，2005，27（3）：58-62.（in Chinese）

[2]REN Jiaoyan，ZHAO Mouming，WANG Jinshui，et al.Novel method for spectrophotometric determination of tryptophan in phydrolysates[J].Food Science，2006，27（12）：591-593.（in Chinese）

[3]WANG Jianqing，ZHANG Yu.Determination of the amino acid of fishmeal by amino acid analyzer[J].Animal Husbandry and Feed Science，2007（6）：37-38.（in Chinese）

[4]HU Baoxiang，YANG Mu，LIU Wenhan，et al.Indirect determination of tryptophan by flame atomic absorption spectrometry[J]. Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory，2006，23（6）：1308-1310.（in Chinese）

[5]YANG Hongbing，LIANG Lanqiu，LU Liliang.Flow injection electrochemiluminescence method for determination of tryptophane[J].Journal of Shihezi University（Natural Science），2005，23（6）：674-675.（in Chinese）

[6]LI Chunxiang，LIANG Yulin，DENG Keqin.Determination of L-tryptophan at electrochemicaly reduced grapheme oxide modifided electode[J].Journal of Analytical Science，2014，29（2）：231-234.（in Chinese）

[7]ZHANG Shaohong，SHI Boan，XI Juan.Investigation on simultaneous determination of tryptophan and cysteine by chemiluminescence method[J].Chinese Journal of Analysis Laboratory，2007，7（26）：5-8.（in Chinese）

[8]WANG Xiaoying，WEI Yongfeng，MA Dongmei，et al.Linear scanning voltammetry for the simultaneous determination of 5-hydroxytryptophan and tryptophan[J].Chemistry，2007（6）：459-462.（in Chinese）

[9]CUI Zhumei，GU Xia，HUANG Youru，et al.The change of tryptophan content in pumpkin seeds during germination determined by fluorescence spectrophotometry[J].Seed，2009，11（28）：62-64.（in Chinese）

[10]ZHANG Bo，LIU Yunjie，QUAN Xiangao.HPLC determination of tryptophan in fermental solution[J].Journal of Jining Medical College，2009，32（2）：116.（in Chinese）

[11]CHENG Likun，XU Qingyang，XIE Xixian，et al.Quick determination of L-tryptophan in fermented broth by HPLC[J].Journal of Tianjin University of Science&Technology，2010，25（1）：9-12.（in Chinese）

[12]XU Lan，AN Wei.Simultaneous determination of tryptophan and tyrosine by UV spectrophotometry[J].Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory，2011，28（5）：2321-2323.（in Chinese）

Study on High Performance Liquid Chromatography Method for Determination of Enzymatic Preparation of L-Tryptophan

CHEN Jun， XU Lisheng， ZHANG Xingtao， DONG Zeng
（College of Biology and Food Engineering，Suzhou University，Suzhou 234000，China）

High performance liquid chromatography method for determination of enzymatic Preparation of L-tryptophan（L-Trp）were studied.The results showed that the optimal parameter were 0.05 mmol/L potassium dihydrogan phosphate-methanol（30∶70）as the mobile phase，the detection wavelength by 265 nm，the flow rate of 1.3 mL/min，separated on a C18 column and 38℃column temperature.The recoveries ranged from 92.00%～110.00%，and the Serine added had no interference to determination of L-tryptophan.The L-Trp in fermentation liquid was separated effectively in these conditions.

high performance liquid，L-tryptophan，enzymatic preparation

S 816.17

A

1673—1689（2017）03—0327—04

2015-03-31

安徽省大学生创新创业训练计划项目（AH20141037906）；宿州区域发展协同创新中心项目（2015SZXTZXKFZD01）；宿州学院科研平台项目（2015ykf02）；宿州学院教授（博士）科研启动基金项目（2014jb06）。

陈 军（1980—），男，安徽萧县人，农学硕士，讲师，主要从事微生物发酵方面的研究。E-mail：cj998001@163.com

陈军，徐礼生，张兴桃，等.高效液相色谱法测定酶法制备L-色氨酸的研究[J].食品与生物技术学报，2017，36（03）：327-330.