白芍总苷对肝癌耐药细胞BEL-7402/ADM耐药性的逆转作用及机制探讨

胡礼仪，侯永彬，余莉华，米永华，王科，刘北忠

(重庆医科大学附属永川医院，重庆402160)

·论著·

白芍总苷对肝癌耐药细胞BEL-7402/ADM耐药性的逆转作用及机制探讨

胡礼仪，侯永彬，余莉华，米永华，王科，刘北忠

(重庆医科大学附属永川医院，重庆402160)

目的 观察白芍总苷(TPG)对肝癌耐药细胞BEL-7402/ADM耐药性的逆转作用，并探讨其作用机制。方法 体外培养人肝癌ADM敏感细胞BEL-7402(亲本组)和ADM耐药细胞BEL-7402/ADM(耐药组)，将BEL-7402/ADM细胞转染HDAC3基因siRNA干扰质粒(干扰组)及空载质粒(空载组)24 h，用白芍总苷孵育BEL-7402/ADM细胞48 h(用药组)。取亲本组、耐药组、用药组细胞，分别以不同浓度ADM作用48 h；MTT法测算增殖抑制率，计算各组ADM的半数抑制浓度(IC50)。取亲本组、耐药组、空载组、干扰组及用药组细胞，分别采用RT-qPCR法和Western blot法检测细胞多药耐药基因MDR1和去乙酰化酶(HDAC3)mRNA和蛋白。结果 亲本组、耐药组和用药组细胞ADM的IC50分别为0.139、8.807、4.890 nmoL/L；用药组细胞对ADM耐药的逆转倍数为1.80倍,逆转率为45.23%。MDR1 mRNA及蛋白相对表达量耐药组、空载组>用药组>干扰组>亲本组(P均<0.05或0.01)，HDAC3 mRNA及蛋白相对表达量耐药组、空载组>干扰组>亲本组、用药组(P均<0.05或0.01)。结论 白芍总苷通过抑制HDAC3的表达，引起MDR1表达下调，从而逆转BEL-7402/ADM细胞的耐药性。

肝癌；白芍总苷；耐药；siRNA干扰；半数抑制浓度；多药耐药基因；去乙酰化酶

肝癌的主要病因为肝炎和肝硬化[1],较其他癌症病死率高。目前，药物化疗如阿霉素(ADM)是其常规治疗方法，但肿瘤细胞的多药耐药(MDR)严重影响化疗效果。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)通过表观遗传调控基因的转录和表达，增强癌细胞耐药性，影响癌细胞的增殖和分化，是一类新型癌症药物靶点；肝癌组织中HDAC3表达显著增高，且与肝癌预后呈负相关[2]。目前，临床上主要应用环孢素A和异博定等来逆转肿瘤细胞的耐药作用，但不良反应较大，患者耐受程度较低。中药在抗癌方面具有有效性高和不良反应低的特点，寻找能逆转肿瘤细胞耐药性且患者耐受程度高的中药在临床应用中具有重要价值[3，4]。有文献[5]报道，白芍对肝炎和其他慢性肝病有治疗作用，白芍总苷是其主要有效成分。2014年4月～2016年3月，我们探讨白芍总苷对人肝癌耐药细胞BEL-7402/ADM的逆转作用，并以siRNA干扰HDAC3表达分析其作用机制，以期为临床上逆转耐药提供更多的药物选择。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人肝癌ADM敏感细胞BEL-7402(亲本组)和ADM耐药细胞BEL-7402/ADM(耐药组)均购买于中国科学院上海生命科学院生化细胞所，将细胞置于含10% FBS、1%青链霉素和1%谷氨酰胺的RPMI 1640培养液中，BEL-7402/ADM细胞培养液中含5 mg/L ADM(海正制药)维持其耐药性[6]，于5% CO2、37 ℃培养箱中培养。每2天换液1次，当细胞融合度达到90%时用0.25%胰酶消化进行细胞传代；实验前2周BEL-7402/ADM细胞换用无ADM的完全培养液培养，取对数生长期细胞用于后续实验。HDAC3基因siRNA干扰质粒及空载质粒由上海吉凯公司构建，参考质粒转染手册分别转染BEL-7402/ADM细胞，培养24 h后获得干扰组和空载组细胞用于后续实验。

1.2 白芍总苷用药前后BEL-7402/ADM细胞对ADM耐药逆转情况观察

1.2.1 白芍总苷用药浓度筛选 白芍总苷片购自三九集团(批号20011201，每片0.3 g，含芍药苷104 mg)，用PBS稀释为40 mg/mL溶液分装冻存备用。采用MTT法观察白芍总苷对BEL-7402/ADM细胞增殖的影响：用完全培养液稀释BEL-7402/ADM细胞至2×104/mL，吹打混匀后，接种200 μL于96孔培养板；将细胞分为观察组和对照组，每组6个复孔；在5% CO2、37 ℃条件下培养24 h，吸去上清液。观察组依次加入含不同浓度(10、20、40、80、160 μg/mL)白芍总苷的培养液，对照组培养液不含白芍总苷，继续孵育48 h后弃培养液；每孔加入无血清培养液及5 mg/mL的MTT各20 μL，继续培养4 h后弃培养液；每孔加入二甲亚飒(DMSO)200 μL，震荡10 min，在全自动酶标仪(Bio-Rad公司，美国)测定490 nm波长时各孔吸光度值(A值)。重复实验3次，取3次平均值。增殖抑制率=(观察组A值-对照组A值)/对照组A值×100%。以增殖抑制率为y坐标，白芍药苷浓度为x坐标,进行回归分析，求得白芍药苷对BEL-7402/ADM细胞的半数抑制浓度(IC50)为71.58 μg/mL。

1.2.2 BEL-7402/ADM细胞对ADM敏感性检测 取亲本组、耐药组细胞，用药组将BEL-7402/ADM细胞用71.58 μg/mL白芍总苷孵育48 h；三组均加入0.90、1.80、3.60、7.20、14.4、28.8、57.6 μmol/L的ADM作用48 h。采用MTT法测算增殖抑制率，方法同1.2.1。使用改良寇氏法计算各组细胞ADM的IC50，并计算逆转倍数及逆转率。

1.3 白芍总苷用药前后BEL-7402/ADM细胞MDR1和HDAC3检测

1.3.1 MDR1和HDAC3 mRNA检测 采用RT-qPCR法。取亲本组、耐药组、空载组、干扰组及用药组细胞，按照TRIzol试剂盒(Life Technologies,美国)说明书提取细胞总RNA，使用NanoDrop®ND-1000紫外吸收法测定RNA浓度与纯度，A260/A280值1.8～2.1。按照Prime ScriptTMRT试剂盒(大连宝生生物工程有限公司)说明合成cDNA。逆转录反应程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min。MDR1上游引物5′-AAGCTTAGTACCAAAGAGGCTCTG-3′，下游引物5′-GGCTAGAAACAATAGYGAAAACAA-3′；HDAC3上游引物5′-TCTGGGCTGTGATCGATTG-3′，下游引物5′-CTTGACATATTCAACGCATTCC-3′；β-actin上游引物5′-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′，下游引物5′-CTAGAAGCATTGCGGTGGACGATGGAGGG-3′；均由大连宝生生物工程有限公司合成。PCR反应体系：10 μL SYBR®Primer Ex TaqⅡ qPCR，0.4 μL 10 μmol/L PCR上下游引物，2 μL cDNA模板和7.2 μL高压水。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；溶解曲线温度55～99 ℃，每2秒下降5 ℃。逆转录和实时定量PCR均在ABI Prism7900 System(Applied Biosystems,美国)仪器中进行。采用2-ΔΔCt法[7]计算基因表达量，以β-actin为内参基因校正得出相对表达量。

1.3.2 MDR1和HDAC3蛋白检测 采用Western blot法。取亲本组、耐药组、空载组、干扰组及用药组细胞，用凯基全蛋白提取试剂盒(江苏生物技术股份有限公司)提取细胞总蛋白；经Bradford法定量后制样，浓度为1 μg/μL。每孔加20 μL蛋白于8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶中90 V电泳2 h；采用半干转，0.3 mA转膜(PVDF膜)50 min；在室温下用5%(W/V)的脱脂牛奶封闭膜2 h；切膜后孵育一抗：MDR1(CST公司；180 kD,1∶1 000)、HDAC3(CST公司，49 kD,1∶1 000)和β-actin(CST公司，42 kD,1∶3 000)，4 ℃冰箱孵育过夜；TBST漂洗3次，10 min/次。用山羊抗兔二体(CST公司，1∶5 000)室温孵育2 h，TBST漂洗3次，10 min/次；膜与Beyo ECL Plus(碧云天生物技术研究所)反应1 min后，经Chemidoc XRS(Bio-Rad公司，美国)显影，用Quantity One软件分析处理。以β-actin蛋白的信号条带为内参，对目的条带(MDR1、HDAC3)光密度值进行半定量，得到目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 白芍总苷对BEL-7402/ADM细胞ADM耐药性逆转情况 亲本组、耐药组和用药组细胞ADM的IC50分别为0.139、8.807、4.890 nmoL/L；用药组细胞对ADM耐药的逆转倍数为1.80倍，逆转率为45.23%。

2.2 白芍总苷对MDR1和HDAC3 mRNA及蛋白表达的影响 MDR1 mRNA及蛋白相对表达量耐药组、空载组>用药组>干扰组>亲本组(P均<0.05或0.01)，HDAC3 mRNA及蛋白相对表达量耐药组、空载组>干扰组>亲本组、用药组(P均<0.05或0.01)。见表1。

表1 各组细胞MDR1、HDAC3 mRNA及蛋白表达比较±s)

注：与亲本组比较，aP<0.05,bP<0.01；与耐药组、空载组比较,cP<0.05，dP<0.01；与干扰组比较，eP<0.05。

3 讨论

白芍为毛莨科植物芍药的干燥根，中医学认为其有补血、补气、止痹、疏通经络的作用，可以治疗自身免疫类疾病、风湿性疾病、肝炎及肝硬化等。白芍的主要药效成分是一组糖苷类物质，其中芍药苷占总苷量的90%以上[5]。通过对白芍总苷的药理及临床研究发现，白芍总苷可以通过多种途径抑制机体免疫反应，从而发挥抗炎、止痛、保肝作用。晏雪生等[8]报道，芍药苷可抑制BEL-7402细胞增殖。本研究发现，用药组细胞对ADM耐药的逆转倍数为1.80倍,逆转率为45.23%。说明白芍总苷对BEL-7402/ADM细胞的耐药性有逆转作用。

MDR1基因可编码P-糖蛋白(P-gp)[9]，P-gp是一种位于细胞膜上的转运蛋白，可通过水解ATP供能，逆浓度梯度将抗肿瘤药物泵出细胞外来实现耐药[10,11]。本研究结果显示，白芍总苷可使耐药细胞MDR1 mRNA和蛋白表达降低，可能导致P-gp在细胞膜上分布减少，使细胞泵出ADM的作用明显减弱，细胞内ADM浓度升高，增强ADM对肿瘤细胞的作用，从而实现其逆转耐药作用。但是，白芍总苷是经过何种途径降低MDR1 mRNA和蛋白表达尚不明确。

HDAC是一类基因表达调控重要的蛋白酶家族，在全身多处组织表达[12]。其中，HDAC3与多种肿瘤的发生、转移和侵袭有关，是明确的致癌基因[2]。Liby等[13]研究发现，HDAC3在高级别胶质瘤细胞内呈强染色。有研究发现，肺腺癌组织中HDAC3高表达，且是患者预后的独立预测因素。HDAC3也在结肠癌组织中高表达，在结肠癌的侵袭以及淋巴结转移中起重要作用[14]。研究[2]发现，肿瘤抗原MageA2通过招募HDAC3到p53的转录位置形成复合物，能同时损害p53的乙酰化和p53结合位点周围的组蛋白乙酰化，并显著下调p53的转录水平，随后使得黑色素瘤细胞对依托泊甙产生抗药性。通常情况下，胞质内HDAC3与IκBα/NF-κB构成静默复合体，HDAC3抑制NF-κB的功能作用，当静默复合体解离时， HDAC3和NF-κB进入细胞核发挥调控作用。有研究发现，NF-κB在很多肿瘤中过度激活，对细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的调节失控[12]。有研究[15]报道，木蝴蝶素通过p53/NF-κB 通路抑制乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADM的增殖，从而减少MDR1基因编码P-gp的表达，逆转细胞对阿霉素的抵抗作用。本研究干扰组通过干扰BEL-7402/ADM细胞HDAC3的表达，发现MDR1基因表达显著下调，这与用药组结果趋势一致。从而证明，白芍总苷通过下调BEL-7402/ADM细胞中HDAC3基因表达，降低其耐药性。因此推测，白芍总苷具有HDAC3抑制剂活性，通过抑制HDAC3的表达，改变细胞内染色质中核小体组蛋白的乙酰化水平，进而下调MDR1基因的表达，从而逆转肝癌耐药细胞的耐药性。本实验的不足之处在于没有进行体内实验，同时没有进一步探索HDAC3逆转MDR1的分子机制，有待今后完善。

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Reversing effects of total glucosides of paeony on drug resistance of BEL-7402/ADM cells

HULiyi,HOUYongbin,YULihua,MIYonghua,WANGKe,LIUBeizhong

(YongchuanHospitalAffiliatedtoChongqingMedicalUniversity,Chongqing402160,China)

Objective To observe the reversing effects of total glucosides of paeonia (TPG) on drug resistance of BEL-7402/ADM cells in hepatocellular carcinoma.Methods Human hepatocellular carcinoma ADM sensitive BEL-7402 cells (parent group) and ADM drug-resistant BEL-7402/ADM cells (drug resistance group) were cultured in vitro. BEL-7402/ADM cells were transfected with HDAC3 siRNA interference plasmid (interference group) and empty plasmid (empty plasmid group) for 24 h, respectively, and BEL-7402/ADM cells were incubated with TPG for 48 h (drug group). Different concentrations of ADM were administered to cells in the parent group, drug resistance group and drug group for 48 h respectively. Then MTT assay was used to detect the growth inhibition rates and IC50of ADM in each group. The mRNA and protein expression of MDR1 and histone deacetylase 3 (HDAC3) was detected by RT-qPCR and Western blotting in the above grovps. Results IC50of ADM was 0.139 nmoL/L in the parent group, 8.807 nmoL/L in the drug resistance group and 4.890 nmoL/L in the drug group. Drug reverse ratio was about 1.80 times higher and the reverse transcription ratio was 45.23% in the drug group. The relative expression of MDR1 mRNA and protein was: drug resistance group, empty plasmid group>drug group>interference group>parent group (allP<0.05, 0.01), the relative expression of HDAC3 and protein was: drug resistance group, empty plasmid group>interference group>parent group, drug group (allP<0.05, 0.01).Conclusion TPG induces the down-regulated expression of MDR1 by inhibiting the HDAC3 expression, thus reversing the drug resistance of BEL-7402/ADM cells.

hepatoma carcinoma; total glucosides of paeony; drug resistance; siRNA interference; 50% inhibition concentration; multidrug resistance gene; histone deacetylase

重庆医科大学附属永川医院引进人才资助项目(YJYJ201306)。

胡礼仪(1972-)，男，硕士研究生，副主任技师，主要研究方向为肿瘤早期诊断的生物标志物。E-mail： hlyhhy@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.10.001

R735.7

A

1002-266X(2017)10-0001-04

2016-09-24)