4种白腐菌预处理提高玉米秸秆厌氧消化性能研究

黄文博， 袁海荣， 刘春梅， 邹德勋， 庞云芝， 李秀金

(北京化工大学 资源与环境工程研究中心， 北京 100029)

4种白腐菌预处理提高玉米秸秆厌氧消化性能研究

黄文博， 袁海荣， 刘春梅， 邹德勋， 庞云芝， 李秀金

(北京化工大学 资源与环境工程研究中心， 北京 100029)

为提高玉米秸秆厌氧消化产气性能，文章采用4种白腐菌(Pleurotusostreatus，Ceriporiopsissubvermispora，Trametesversicolor和Phanerochaetechrysosporium)对其进行预处理。通过测定白腐菌微生物生长曲线及进行厌氧消化实验验证，发现C.subvermispora预处理效果最佳，能够在15天时间内径向完全覆盖秸秆，生长速率大，为167.75 μm·h-1，对木质素的相对选择降解系数最高，为0.85。厌氧消化实验结果显示，C.subvermispora预处理玉米秸秆累积产甲烷量为225.94 L·kg-1VS，较未预处理提高了12.32%，T80产气周期缩短8天。说明，C.subvermispora预处理能够提高玉米秸秆厌氧消化产气性能。

白腐菌； 玉米秸秆； 木质纤维素； 相对选择降解性； 厌氧消化

中国是农业大国，2014年，我国秸秆总产生量约为8.3亿吨，其中玉米秸秆所占比例约为30%[1]，具有巨大的应用潜力。

秸秆中具有丰富的可利用木质纤维素，其中，纤维素和半纤维素这两种聚糖类物质组成的碳水化合物(占干物质总量的55%～75%)是主要的甲烷转化组分。但是，木质素通过与植物细胞壁中部分碳水化合物交联，形成复杂的三维立体结构，将纤维素和半纤维素包裹其中，形成生物质抗降解屏障，具备一定疏水作用，大大降低了微生物对底物的接触，以及初始分泌的酶的吸附和水解效率[2]。因此，采用高效的预处理方式对秸秆进行去木质素处理，提高其可生物利用性，是目前秸秆类底物厌氧消化的关键。

秸秆预处理方式主要包括物理法、化学法、生物法和联合预处理[3]。白腐菌预处理是生物法中的一种，因其高效去木质作用和环境友好性而备受关注。Otjen[4]等以桦树和桉树为底物，评估30种白腐菌降解过程中的木质素选择降解性，实验发现，白腐菌木质素选择降解性与菌种和底物种类均有一定关联，木腐型白腐菌能够在局部范围内完全降解木质素并完整保留纤维素，而底物中碳水化合物与木质素含量比值越高，越有利于木质素的降解。自20世纪60年代起人们逐渐开始将白腐菌预处理应用于厌氧消化技术的研究。Müller[5]等使用22种白腐菌预处理稻草，发现不同菌种对稻草中木质纤维组分的选择降解性有明显差异，随后将预处理后稻草与牛粪混合进行厌氧消化，结果显示经木质素选择降解性较高的菌种预处理的稻草产气性能更好，Pleurotussp.“florida”预处理后产气量为对照组2倍。López[6]等利用Phanerochaeteflavido-alba对几种农业和林业废弃物进行预处理，发现木质纤维材料的种类对预处理的效果有一定影响，其木质化程度越高，木质素选择降解性越高，预处理对其产气性能的提高越明显。Arora[7]等发现不同地区的麦秸经同种白腐菌预处理，木质素选择降解性也存在差异。Lalak[8]等研究含水率对白腐菌预处理长穗偃麦草厌氧消化性能的影响，发现在65%含水率条件下，Flammulinavelutipes对木质素的去除率最高，为35.4%，而对纤维素的保留程度最高，为79.52%，产气量提高120%。由此可见，针对特定底物和预处理条件选择相应的高木质素选择性菌种，是提高厌氧消化产气性能的关键。

因此，笔者实验采用Pleurotusostreatus，Ceriporiopsissubvermispora，Trametesversicolor和Phanerochaetechrysosporium4种白腐菌预处理玉米秸秆，通过预处理过程中微生物生长曲线和木质纤维素组分变化，筛选最适预处理菌种，进行厌氧消化实验验证，并结合模型拟合的方式进行分析，以提高玉米秸秆厌氧消化产气性能。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用菌种Pleurotusostreatus(ACCC 52857)，Ceriporiopsissubvermispora(ACCC 32475)购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，Phanerochaetechrysosporium(CICC 40299)，Trametesversicolor(CICC 50001)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

实验所用玉米秸秆取自北京市延庆区，接种物取自北京市顺义区某沼气站，其主要性质示于表1中。

1.2 实验方法

1.2.1 接种物的培养

菌种的培养采用综合PDA培养基：20%马铃薯汁1000 mL，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，硫胺素(VitB1)微量，琼脂15 g，自然pH值。平板扩增，25℃～28℃培养5天。

1.2.2 白腐菌生长曲线的测定

表1 原料及接种物性质

根据Santi[9]等所用方法，含水率为65%的灭菌玉米秸秆接种直径9 mm菌块1块，置于直径90 mm培养皿，自然pH值，25℃～28℃下培养15天[10-11]，测量24 h菌丝径向覆盖区域直径变化。

Kr=(R1-R0)/(t1-t0)

(1)

式中：R0，R1为t0和t1时菌落半径，cm。

R(t)=a/[1+bexp(-kt)]

(2)

式中：R(t)为时间t时菌落半径，cm；T为菌落生长时间，d。

生长曲线Slogistic模型[13]由公式(3)计算所得。

(3)

1.2.3 木质纤维素含量变化测定

含水率为65%的玉米秸秆置于17 cm×33 cm×5 cm聚丙烯袋，经121℃高压蒸汽灭菌处理30 min后接种直径9 mm菌块3块，自然pH值，28℃预处理15天，测定预处理结束后秸秆木质纤维素含量。

白腐菌木质纤维素选择降解系数Srel[14]可由公式(4)计算得到。

(4)

式中：L1为木质纤维素初始含量，%；L2为预处理后木质纤维素含量，%；WL为失重，%。

1.2.4 厌氧消化产气性能实验

含水率为65%的玉米秸秆置于17cm×33cm×5cm聚丙烯袋，经121℃高压蒸汽灭菌处理30min后接种直径9mm菌块3块，自然pH值，28℃预处理15天，对照组为未经预处理玉米秸秆。厌氧消化实验采用1L蓝盖瓶，工作体积800mL。秸秆有机负荷为50gTS·L-1，接种污泥有机负荷为15gMLSS·L-1，pH值为6.8～7.2。实验组与对照组均设3重复。

TS和VS根据AmericanPublicHealthAssociation(APHA) 中推荐的方法进行[15]。厌氧消化过程产气量采用排水法测定；所得气体组分含量采用气相色谱(北分，SP-2100A)测定(TDX-01填充柱，TCD检测器)。pH值采用Orion3-Star型pH计测定。木质纤维素含量采用全自动纤维分析仪(ANKOM2000I)测定。

累积产甲烷量Gompertz模型可由公式(5)[16]计算得到。

式中：P(t)为累积产甲烷量，L·kg-1VS；Pm为拟合产甲烷潜力，L·kg-1VS；Rm为最大产甲烷率，L·kg-1VSd-1；λ为延滞期，d。

2 结果与讨论

2.1 白腐菌预处理效果的研究

2.1.1 生长曲线的测定与拟合

白腐菌能够在玉米秸秆上生长，并同时通过木质素降解酶系的协同作用对其进行生物降解和转化。但是不同种类的白腐菌在玉米秸秆上的生长情况具有明显差异。

图1和图2分别为不同种类白腐菌在玉米秸秆上的生长曲线及其Slogistic模型拟合。图3～图6为菌丝具体生长情况。可以看出，在15天实验周期中，不同白腐菌在玉米秸秆上菌丝生长情况均有所不同，大致可分为两类，C.subvermispora和P.ostreatus生长较快，其中，C.subvermispora在第11天首先达到径向完全覆盖(9cm)，P.ostreatus在第12天达到径向完全覆盖。T.versicolor，P.chrysosporium生长较慢，12天时菌落均停止扩增，覆盖范围分别为5.7cm和5cm。

图1 T.versicolor，P.chrysosporium，C.subvermispora和P.ostreatus在玉米秸秆上菌丝生长曲线

图2 T.versicolor，P.chrysosporium，C.subvermispora和P.ostreatus在玉米秸秆上生长曲线Slogistic模型拟合

图3 T.versicolor在玉米秸秆上菌丝生长情况

图4 P.chrysosporium在玉米秸秆上菌丝生长情况

图5 C.subvermispora在玉米秸秆上菌丝生长情况

图6 P.ostreatus在玉米秸秆上菌丝生长情况

表2所列不同菌种径向生长速率Kr和生长曲线Slogistic模型拟合所得参数也证明了这一结果。

表2 不同菌种生长曲线Slogistic模型拟合参数及径向生长速率Kr

真菌预处理应该在尽可能短的周期内达到对整个秸秆的完全覆盖，降解木质素的同时尽可能少的消耗纤维素和半纤维素，由此可见，能够在15天时间内完全覆盖秸秆，径向生长速率大，快增期短的C.subvermispora较适宜在玉米秸秆上生长和作为预处理菌种使用。

2.1.2 木质纤维素含量变化测定

由于不同菌种在玉米秸秆上的菌落生长情况有较大差异，因此，对其预处理过程中木质纤维素含量的变化进行考察，探寻不同菌种预处理过程中对木质纤维素降解的效果。可以看出，经15天预处理后，不同菌种对玉米秸秆木质纤维素组分降解效果具有明显差异。白腐菌对木质纤维素的降解大致可分为选择性降解和非选择性降解两种类型[4]。由图7可以看出，P.chrysosporium对玉米秸秆木质纤维素各组分的降解不具备选择性，对纤维素、半纤维素和木质素的降解率基本相同，而其余3种菌种对木质素的降解率明显高于纤维素和半纤维素，更具选择性，其中，T.versicolor对木质素的降解率最高，达到60.98%。

图7 不同菌种预处理玉米秸秆木质纤维素降解效果

图8 不同菌种预处理玉米秸秆TS和VS降解率

白腐菌木质纤维素选择降解系数Srel能够直观反映白腐菌对木质素降解的专一性。图8表明T.versicolor和P.chrysosporium对秸秆VS降解率最高，分别为18.08%和19.81%，且T.versicolor对木质素的降解率也是最高，但由计算所得Srel值发现，T.versicolor和P.chrysosporium的木质素选择降解性并不好。尽管C.subvermispora对玉米秸秆组分整体的降解效果(TS和VS降解率)并不是最高，但由图9和图10中Srel对应木质素降解率和干物质降解率的分布情况可以看出，在木质素和干物质损失较小的情况下，C.subvermispora的Srel值最高，为0.85，表明其降解木质素的专一性和效率高于其他菌种。相反，P.chrysosporium对秸秆整体降解率最高，但对木质素的选择性最差，只有0.36，表明这种菌种对木质纤维素不同组分的降解并无针对性。这与不同菌种在玉米秸秆上的生长速率具有一定关联性，由于C.subvermispora在秸秆上的增长速率最高，能够快速覆盖秸秆，对秸秆整体降解率较低，但对包裹在最外层的木质素降解较完全。P.chrysosporium径向扩增慢，除降解木质素外，还消耗了大量的纤维素与半纤维素。

图9 不同菌种预处理玉米秸秆木质素选择降解系数(相对木质素降解率)

图11 不同菌种预处理玉米秸秆纤维素选择降解系数(相对纤维素降解率)

纤维素和半纤维素的构成单体主要为糖类，是主要的甲烷转化组分，因此在预处理阶段，对这两种组分进行断链和解聚，而降解后产物应尽可能保留，减少消耗[2]。由图11～图14中，不同菌种纤维素、半纤维素选择降解系数看出，C.subvermispora虽然对半纤维素有较强选择降解性，但对纤维素的保留程度最高，Fernandez Fueyo[17]等研究认为C.subvermispora在降解过程中，调控锰过氧化物酶的基因的表达要高于其他菌种，而调控多糖水解酶的基因表达相对较少，因此使其对木质素的降解更具选择性。

综上所述，C.subvermispora对木质素的选择降解效果最为明显，对玉米秸秆的预处理效果最佳。

2.2 厌氧消化产气效果的研究

日产甲烷量和甲烷含量能够直观的反映厌氧消化过程的稳定性和各阶段的变化趋势。由图15日产甲烷量可以看出，不同菌种预处理玉米秸秆在厌氧消化过程中反应更加平稳，无明显的产气高峰和酸化现象产生。甲烷转化主要集中在前20天左右。而未预处理秸秆则由于酸化现象在初始阶段产生了7天左右的延滞，反应过程中有明显的3个产气高峰，波动性较大。图16所示甲烷含量变化可以看出，经白腐菌预处理玉米秸秆在厌氧消化过程中能够更快进入稳定的甲烷化阶段，甲烷含量稳定在60%左右的时间更长，而未预处理秸秆甲烷含量波动较为明显，直到25天后才趋于稳定。因此表明，白腐菌预处理能够加快厌氧消化甲烷化进程，提高反应的稳定性，不同菌种预处理变化趋势基本相同。

图10 不同菌种预处理玉米秸秆木质素选择降解系数(相对干物质降解率)

图12 不同菌种预处理玉米秸秆纤维素选择降解系数(相对干物质降解率)

图13 不同菌种预处理玉米秸秆半纤维素选择降解系数(相对半纤维素降解率)

图15 不同菌种预处理厌氧消化日产甲烷量

厌氧消化累积产甲烷量和T80产气周期是反映厌氧消化产气性能和工业应用可行性的两个重要指标[18]。对4种不同菌种预处理玉米秸秆进行周期45天的厌氧消化实验，其累积产甲烷量和累积产甲烷量Gompertz模型拟合分析分别示于图17和图18和表3中。

由图17可以看出，不同菌种预处理厌氧消化45天累积产甲烷量具有明显差异，其中，C.subvermispora预处理玉米秸秆累积产甲烷量最高，为225.94 L·kg-1VS，较未预处理提高了12.32%。其余3种菌种预处理后累积产甲烷量均有一定程度的降低。根据预处理实验结果分析，认为纤维素和半纤维素的损耗可能是导致这一结果的主要原因。Feng Xinmei[19]等对Pleurotusostreatus和Pleurotuseryngii两种欧洲和亚洲常见食用菌预处理麦秸的厌氧消化实验也得到了类似的结果，表明白腐菌预处理对秸秆中纤维素和半纤维素的消耗是影响其甲烷产量的主要原因。

图14 不同菌种预处理玉米秸秆半纤维素选择降解系数(相对干物质降解率)

图16 不同菌种预处理厌氧消化甲烷含量

图17 不同菌种预处理厌氧消化累积产甲烷量

图18 不同菌种预处理厌氧消化累积甲烷产量Gompertz模型拟合

白腐菌预处理能够有效破坏秸秆木质纤维素结构，使其更易被厌氧微生物所利用，这一优势主要体现在对T80产气周期的影响上。图17可以看出，不同菌种预处理均可加快厌氧消化进入甲烷化的进程，T80产气周期较未预处理提高了8～9天。表3中Gompertz模型拟合参数λ表示厌氧消化延滞期，可以看出，经白腐菌预处理后延滞期缩短8～9天，与T80产气周期结果一致，这也能够在一定程度上弥补前期预处理时间的损耗，使白腐菌预处理具备一定的应用可行性。

表3 不同菌种预处理厌氧消化累积产甲烷量Gompertz模型拟合参数

综合累积产甲烷量和T80产气周期两项指标考虑，C.subvermispora能够提高玉米秸秆厌氧消化产气性能，这一结果与预处理效果的研究结论一致。

2.3 厌氧消化过程生物降解性与物质转化

对不同白腐菌预处理玉米秸秆厌氧消化过程中物质转化分析，能够直观的反映厌氧消化过程中木质纤维素不同组分甲烷转化的程度，从而解释白腐菌预处理如何影响玉米秸秆厌氧消化产气性能。

将玉米秸秆中有机组分采用概化分子式CaHbOcNd表示理论甲烷产量是当底物完全转化成甲烷时的最大体积(标况下)。根据文献，秸秆的理论甲烷产量可通过经验方程(公式6和公式7)得到[20]。生物降解性可由公式8得到。

(6)

(7)

(8)

式中：VT为理论产甲烷量，L·kg-1VS； Vc为累积产甲烷量，L·kg-1VS。

结合元素分析，计算得到不同菌种预处理后和未预处理玉米秸秆理论产甲烷量和生物降解性示于表4中。可以看出，经白腐菌预处理后，由于碳源的损失，玉米秸秆的理论产甲烷量均有不同程度的降低。C.subvermispora预处理后秸秆的生物降解性较未预处理提高了20.38%，其他3种菌种预处理后均导致生物降解性一定程度的降低。通过厌氧消化前后木质纤维素组分的降解情况计算得到纤维素、半纤维素和木质素在厌氧消化过程中对甲烷的转化贡献率，发现经白腐菌预处理后，各木质纤维素组分甲烷转化贡献率均低于未预处理组，表明了白腐菌预处理虽然破坏了木质纤维素结构，但降解过程中同样会消耗一部分可用于厌氧消化的有效碳源组分使得各组分甲烷转化率和整体生物降解性受到影响。综上所述，C.subvermispora能够强化玉米秸秆厌氧消化产气性能。

3 结论

研究发现在预处理阶段C.subvermispora能够在15天时间内完全覆盖玉米秸秆，径向生长速率大，为167.75μm·h-1，快增期短，Srel最高为0.85，预处理效果最好，通过厌氧消化产甲烷性能验证发现，C.subvermispora能够提高累积产甲烷量12.32%，缩短T80产气周期8天，提高生物降解性20.38%，能够提高玉米秸秆厌氧消化产气性能。

表4 不同菌种预处理厌氧消化过程中物质转化

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Pretreatment Comparison of Corn Stover by Different Kind of White-rot Fungi for Improving Biomethane Production /

HUANH Wen-bo, YUAN Hai-rong, LIU Chun-mei, ZOU De-xun, PANG Yun-zhi, LI Xiu-jin /

(Beijing City Environmental Pollution Control and Resource Reuse Engineering Research Center, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China)

Pretreatment of corn stover byPleurotusostreatus,Ceriporiopsissubvermispora,TrametesversicolorandPhanerochaetechrysosporiumwere studied in this paper for enhancing biomethane production.C.subvermisporawas able to fully colonize the corn stover in 15 days and had the highest radial growth rate of 167.75μm·h-1. And its relative selectivity to lignin was 0.85, which was better than the other three strains. The cumulative biomethane production of pretreated corn stover byC.subvermisporawas 225.94 L·kg-1VS, which was 12.32% higher than that of untreated. And the digestion period (T80) was 8 days, which was shorter than that of untreated. Therefore,C.subvermisporawas the optimal strain for pretreatment of corn stover for biomethane production.

white-rot fungi; corn stover; lignocellulose; relative selectivity; anaerobic digestion

2016-10-14

项目来源： 科技部十二五科技支撑计划(2014BAC24B01;2014BAL05B03;2015BAD21B03)

黄文博(1991- )，女，北京石景山人，博士，主要从事固体废物资源化利用方面的科研工作，E-mail:iorhwb@163.com

李秀金，E-mail:xjli@mail.buct.edu.cn

S216.4； X712

A

1000-1166(2017)02-0028-08