升降散对DM大鼠肠道菌群结构变化及炎症因子的影响

孙晓泽 杜芬芬 刘爱华*

升降散对DM大鼠肠道菌群结构变化及炎症因子的影响

孙晓泽1杜芬芬2刘爱华1*

（1河南省中医院干部病房，郑州450002；2河南中医药大学硕士研究生2014级，郑州450046）

目的观察升降散对糖尿病大鼠乳酸杆菌、肠链球菌及TNF-α的影响，探讨其作用机制。方法链脲佐菌素诱导建立糖尿病模型，成模大鼠分为模型对照组和治疗组（拜糖平组、升降散低剂量组、升降散中剂量组、升降散高剂量组），各组按相应药物剂量灌胃治疗6周后，采用Elisa法检测TNF-α、INS，Realtime PCR技术进行细菌定量测定。结果治疗前，模型组空腹血糖（FBG）、TNF-α、INS及肠链球菌均明显升高，乳酸杆菌数量明显减少；治疗前后，正常对照组及模型对照组各指标无明显变化。治疗后，各治疗组FBG在2周、4周及6周逐渐降低，且均高于同时间正常对照组，低于同时间模型对照组（P＜0.05）；TNF-α、INS较模型对照组明显减少，但同时高于正常对照组（P＜0.05）；肠链球菌数量较模型对照组明显减少，较正常对照组以拜糖平组及升降散中剂量组减少明显，差异均有统计学意义（P＜0.05）；乳酸杆菌数量较模型对照组、正常对照组明显增多（P＜0.01）。结论升降散能通过增加益生菌数量，降低致病菌数量达到调整肠道菌群结构的目的，从而抑制炎症状态，降低血糖。其部分作用机制可能是通过调整肠道菌群、抑制炎症因子而减轻胰岛素抵抗（IR），增加胰岛素利用率实现的。

升降散；糖尿病；肠道菌群；炎症因子；动物实验；腹泻

随着大量实验研究证实肠道菌群与肥胖、糖尿病等代谢性疾病密切相关，肠道菌群已成为代谢性疾病防控的新方向。研究表明，肠道菌群失调可诱发慢性炎症进而诱发胰岛素抵抗，从而导致糖尿病发生，但其机制尚未十分明确。Zhang等[1]运用16Sr DNA高通量测序方法，发现机体代谢参数和菌群多样性两者间有显著的关联性。此为肠道菌群的结构可调控糖尿病的发病机制研究提供了证据。现有关于肠道菌群失调导致肥胖及2型糖尿病发生的研究，多数观点集中认为肠道乳酸菌、双歧杆菌等益生菌的减少与糖耐量异常密切相关。中药升降散为临床调理脾胃气机的常用治疗大法，前期研究证实，其改善糖尿病的症状及降低血糖效果颇佳。本研究通过制作DM大鼠模型，观察升降散对DM大鼠肠道菌群（乳酸杆菌、肠链球菌）结构变化及相关炎症因子（TNF-α）的影响，探讨其部分作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物SD雄性大鼠70只，SPF级，体重（140～160）g，由郑州大学动物实验中心提供，合格证号：41003100002297。清洁环境中饲养，室内温度维持在25℃左右，自由摄水。

1.2 药品与试剂升降散药物组成（僵蚕10 g，蝉蜕6 g，姜黄6 g，大黄3 g），药物购自河南省中医院，由三九颗粒制药提供，颗粒剂总重量为7 g；拜糖平/阿卡波糖片（德国拜耳公司）；链脲佐菌素（STZ）（美国Sigma公司）；SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2X)）Fermentas公司）；Ex TaqTM、DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker（TAKARA公司）；引物合成，擎科新业生物技术有限公司提供；基因组DNA提取试剂盒，北京天根生化科技有限公司生产，批号：DP328；大鼠IL-6 Elisa检测试剂盒、大鼠INS Elisa检测试剂盒，河南天驰生物有限公司提供，批号：CK-E30646R、CK-E30620R。

1.3 仪器血糖测定仪：稳豪倍优型血糖仪（强生医疗器械有限公司）；实时荧光定量PCR仪、荧光定量PCR管（ABI）；水平电泳仪、紫外分析仪（北京君意东方电泳设备有限公司）。

2 研究方法

2.1 动物造模70只大鼠普通饲料适应性喂养1周后，按6∶1随机先分为造模组和正常组。正常组予标准饲料喂养，造模组予高脂高糖高胆固醇饲料喂养至满8周后，腹腔注射STZ30 mg/kg，正常组对照组注射等体积0.1 mol/L无菌枸橼酸缓冲液。72 h后测大鼠空腹血糖（禁食8～10 h），空腹血糖≥11.1 mmol/L认为糖尿病大鼠造模成功。剔除未成模及死亡8只。

2.2 分组与给药取50只成模大鼠按随机数字表法分为模型对照组、拜糖平组、升降散高、中、低剂量组。拜糖平组每日灌胃（ig）70 mg·kg-1；升降散低、中、高剂量组，每日ig升降散(0.753，1.506，3.012 g·kg-1)，模型对照组与正常组每日ig等量生理盐水。每3天称体重，根据体重调整给药量。药物干预6周后进行各指标的观察检测。

2.3 标本采集与指标检测

2.3.1 一般情况治疗期间观察大鼠精神状态、皮毛色泽、饮水量、尿量、体重等。

2.3.2 生化指标检测每周血糖仪测空腹血糖值；治疗第6周末，10%的水合氯醛动物麻醉后取血标本，ELISA法检测血清TNF-α、INS。

2.3.3 Realtime PCR技术测定乳酸杆菌、肠链球菌按试剂盒说明书取0.2 g大鼠新鲜粪便进行基因组DNA提取，以其为模板做PCR扩增，扩增片段引物lactobacillus（341bp）：lacto F：AGCAGTAGGGAATCTTCCA，lacto R：CACCGCTACACATGGAG；Enterococcus（144bp）：Enter F:CCCTTATTGTTAGTTGCCATCATT，Enter R:ACTCGTTGTACTTCCCATTGT。在PCR反应体系中，加入SYBR荧光染料，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

2.3.4 统计学方法采用SPSS 17.0软件，计量数据采用（x±s）表示，组内比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况观察正常组大鼠精神状况良好，反应灵敏，饮食及尿量正常，毛色有光泽，体重稳定增加。其余各组注射STZ后明显消瘦，并出现多饮、多食、多尿、精神萎靡，毛色发黄无关泽等症状。

3.2 各组大鼠不同时间点血糖值的比较见表1。

表1 不同时间点各组大鼠血糖值比较（n=8，x±s，mmol/L）

3.3 各组大鼠治疗前后TNF-α、INS的比较见表2。

表2 各组大鼠治疗前后TNF-α、INS的比较（n=8，x±s）

3.4 乳酸杆菌、肠链球菌Realtime PCR定量分析见表3。

表2 各组大鼠治疗前后乳酸杆菌、肠链球菌的比较（n=8，x±s）

4 讨论

肠道菌群做为人体最大微生态系统，参与并影响着人体物质与能量代谢，目前多项研究表明，肠道菌群与糖尿病的发生发展密切相关，其作用机制可能为[6-9]：首先，肠道细菌可提高能量转化效率，能将食物中宿主自身不能分解的碳水化合转化为代谢终产物—短链脂肪酸（SC-FAs），肠道菌群失调可诱发机体内SCFAs水平和构成发生异常，如此肠道抗炎症反应能力、脑肠肽激素分泌功能等受到影响，会引起胰岛细胞功能受损、胰岛素抵抗的发生；其次，高脂饮食可改变肠道细菌的环境，肠道菌群失调导致革兰阴性菌比例的增多、肠壁通透性增加或者肠道菌群移位，通过产生和吸收更多的LPS，激活胰岛的低度慢性炎症，炎症可能通过多种途径导致胰岛β细胞结构受损与功能障碍，促进β细胞凋亡。同时，2型糖尿病本身亦会导致肠道菌群紊乱，削弱肠道屏障作用，刺激机体免疫系统所产生的IL-6、TNF-a等细胞因子，促使胰岛细胞功能进一步受损，如此形成恶性循环。因此，通过调控肠道菌群的组成或许能为糖尿病的治疗提供新策略。

中医强调以整体论治，对此单方面的研究甚少，对其病因病机的研究散见于消渴病的文献中。总结前人其病因的认识大致为禀赋虚弱、饮食失节、情致失调及劳欲过度，其病机以阴虚燥热为主流。但疾病是发展的，病因病机亦是发展的。刘爱华教授基于多年对DM临床观察和总结的基础上，应用中医病因病机学基本理论、继承脾胃学家李东垣、国医大师李振华“升清降浊”学说，并在查阅相关的文献资料，运用类比、归纳、演绎多种方法，经过较严密的逻辑思维过程，创新提出“脾失升清，浊毒下陷”之假说，认为DM的发病与脾胃气机升降失常、痰浊瘀毒逆乱有关，而且认为“脾失升清，浊毒下陷”气机升降是根本。故用升降散，以僵蚕、蝉蜕、姜黄、大黄，共研细末，以黄酒、蜂蜜为引导，蝉蜕、僵蚕升阳中之清阳；片姜黄、制大黄降阴中之浊阴，则杂气之流毒顿消矣。现代药理亦研究证实升降散具有抗炎、抗病毒、抗过敏、解痉，利胆，抗惊厥，调节免疫等功能[10]。

本实验结果显示：治疗前，模型组FBG、TNF-α、INS及肠链球菌均明显升高，乳酸杆菌数量明显减少。治疗前后，正常对照组及模型对照组各指标无明显变化。治疗后，各治疗组乳酸杆菌量较模型对照组、正常对照组明显升高，肠链球菌量较模型对照组明显减少，较正常对照组以拜糖平组及升降散中剂量减少明显；TNF-α、INS较模型对照组明显减少，但同时高于正常对照组；FBG在2周、4周及6周逐渐降低，但均高于同时间正常对照组，低于同时间模型对照组。由此推测，升降散能通过增加益生菌数量，降低致病菌数量达到调整肠道菌群结构的目的，从而抑制炎症状态，减轻胰岛素抵抗（IR），增加胰岛素利用率而降低血糖。

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Effects of Shengjiang Powder on Intestinal Flora Structure Change and Inflammation Factor In DM Rats

SUN Xiaoze1,DU Fenfen2,LIU Aihua1
(1.The VIP Ward,Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 4500021,China; 2.Grade 2014 Graduate,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 4500046,China)

ObjectiveTo investigate the effects of Shengjiang powder on intestinal flora structure change and inflammation factor in DM rats,and to explore its action mechanism.MethodsThe model rats of DM were established by injecting streptozotosin,and then they were randomly divided into model control group and treatment group(acarbose group,groups of low,medium,high dose of Shengjiang powder).After the treatment for 6 weeks,Elisa method was used to detect TNF-α,INS,Realtime PCR technology for quantitative determination of bacteria.ResultsBefore treatment,the FBG,TNF-α,INS and Enterococcus of the model group were significantly increased,and the lactobacillus quantity of the model group decreased significantly.The indexes of the normal control group and model control group had no significant change before and after treatment.After treatment,FBG of the treatment groups in 2 weeks,4 weeks and 6 weeks were gradually decreased,which was higher than that of the normal control group,and which was lower than that of the model group and the control group at the same time(P＜0.05).The TNF-α and INS quantity of the treatment group decreased significantly comparing with model control group,but at the same time,which was higher than that of the normal control group(P＜0.05).The Enterococcus quantity of the treatment groups decreased significantly compared with model control group,but the acarbose group and medium group of Shengjiang powder decreased significantly comparing with normal control group.The lactobacillus quantity of the treatment groups increased significantly comparing with model group and normal control group(P＜0.01).ConclusionShengjiang powder can spread by increasing the number of probiotics,reducing the number of pathogenic bacteria to adjust the structure of intestinal flora,thus inhibiting the inflammatory state to reduce FBG.Some of its mechanism may be through adjusting the intestinal flora,inhibiting inflammatory factor to insulin resistance(IR),increase the utilization rate of insulin.

Shengjiang powder;DM rats;intestinal flora;inflammation factor;animal experiment;diarrhoea

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.08.056

1672-2779（2017）-08-0135-03

张文娟 本文校对：王会喜

2016-12-13）

*通讯作者：liuaihua666888@sina.com