肝郁脾虚型FD大鼠模型的建立及评价※

陈婕 张津玮 杨岩 胡建功 李慧臻 杜潇 王天麟 孔祥茹

实验研究∥Experimental Study

肝郁脾虚型FD大鼠模型的建立及评价※

陈婕1张津玮3杨岩2胡建功4李慧臻1杜潇2王天麟2孔祥茹2

（1天津中医药大学第二附属医院消化科，天津300193；2天津中医药大学研究生院，天津300073；
3天津中医药大学第二附属医院神经内科，天津300193；2天津中医药大学第二附属医院病理科，天津300073)

目的建立肝郁脾虚型功能性消化不良(FD)大鼠模型。方法SD大鼠40只，随机分为空白组、模型组、胃泰组、吗丁啉组，每组各10只。模型组采用夹尾联合不规则喂养法建立FD大鼠模型，用32 mm蝴蝶夹夹鼠尾后1/3处，30 min后放开，每日1次；每周予二、四、六禁食，余日给足量饲料，持续4周。观察比较2组大鼠一般状态、体质量增长情况、糖水消耗实验、敞箱实验(open-field法)、胃内残留率测定（胃排空率测定）、小肠推进率的测定、一氧化氮（NO）、神经降压素（NT）、胃窦组织形态学变化。结果大鼠逐渐出现精神倦怠、体重增长缓慢、糖水消耗减少、大鼠活动减少、胃内残留率增加/胃排空率降低、小肠推进率降低、无炎症细胞浸润等病理组织学改变。结论本造模方法简单易行，可重复率高，值得进一步推广与应用。

功能性消化不良；动物模型；肝郁脾虚；动物实验研究

功能性消化不良(functional dyspepsia，FD)是临床上最常见的一种功能性胃肠病(functional gas-trointestinal disorders，FGID)，且其具有慢性、复发性和难以缓解性的特点[1]，主要表现为上腹部不适：胃疼、烧心、餐后不适和胃部饱胀感等，而不能通过器质性原因来解释这些症状的消化不良，也是功能性胃肠疾病(functional gastrointestinal disor-ders，FGID)的其中之一。FD虽然病位在胃肠，但其发病与五脏相关，其中与肝脾尤为密切，肝郁脾虚为胃肠功能紊乱的病理本质[2]。欧美流行病学调查显示：普通人群中患消化不良症状者占19%～41%，而我国发病率为20%～30%[3]。近年来国内外学者对FD发病过程中生理-心理-社会模式的重视及脑-肠轴概念的明确，精神心理因素已成为近年来研究的热点[4]。

1 材料与方法

1.1 动物健康雄性SD大鼠50只，体重(250±10)g，购自北京军事医学科学院动物实验中心，合格证编号：SCXK(京)2009-0017，置于标准实验条件下饲养[室温（24±2）℃，湿度（55±5）%]。

1.2 仪器电子秤32 mm蝴蝶夹；全自动真空组织脱水机：Leica ASP300 S；组织包埋机：Leica EG1160；轮转式石蜡切片机：Leica RM2235；光学显微镜及显微摄像系统：OLYMPUS。

1.3 分组大鼠随机分为4组，空白组、模型组、胃泰组、吗丁啉组，每组10只。除空白组外，其它各组采用夹尾联合不规则喂养法建立FD大鼠模型。

1.4 造模方法32 mm蝴蝶夹夹鼠尾后1/3处，30 min后放开，每日1次；每周予二、四、六禁食，余日给足量饲料，持续4周。

1.5 造模成功评价标准通过大鼠的一般状态观察、体重增长情况、糖水消耗实验、敞箱实验、胃内残留率测定/胃排空测定、小肠推进率测定、胃组织形态学变化判断造模成功与否。

1.6 模型评价

1.6.1 一般状态的观察每日观察大鼠神态、毛色、进食量、排泄物性状及体重变化等；观察每日夹尾时，大鼠是否出现嘶叫、激惹、打斗、躲避、畏惧、扎堆儿、少动、神态倦怠等倾向。

1.6.2 体重增长情况动态观察大鼠体重增长情况。

1.6.3 糖水消耗实验大鼠禁食禁水24 h后，给予每组大鼠一瓶1%糖水(已称质量)，1 h后取走糖水瓶再次称量质量，两次称质量的差值即为1%糖水摄取量，于实验第7、14、21、28 d各称量l次。

1.6.4 敞箱实验(open-field法)使用自制敞箱70 cm×70 cm×40 cm，敞箱的四壁及底面均涂成黑色，底面用粉笔划分成等面积的25个方块。实验时将大鼠置于敞箱底面正中的方格内，以大鼠穿越底面的格数(三爪均踏入方格内可计数)为水平运动的次数；以前肢离地次数(前肢腾空或攀附箱壁)为垂直运动次数，每只大鼠在实验第7、14、21、28 d各测定l次，3 min/次。

1.6.5 胃肠动力测定

1.6.5.1 胃内残留率测定（胃排空率测定）实验前大鼠禁食不禁水12 h，用碳素墨水灌胃(l ml/100 g)，30 min后用10%水合氯醛麻醉大鼠，剖腹取胃，称取质量为全胃质量，沿胃小弯侧剪开胃壁，冲净胃内容物，滤纸吸干，称取质量为空胃质量，计算胃排空率。胃内残留率(%)=(全胃质量-空胃质量)/灌入量×100%。实验第28 d随机抽取6只模型组大鼠、及空白组6只大鼠进行检测。胃排空率=[1-(全胃质量-空胃质量)/灌入量]×100%。

1.6.5.2 小肠推进率的测定分离肠系膜，剪取幽门至回盲部的肠管，置于白纸上，轻轻拉成直线，测量肠管长度为小肠总长度，从幽门至碳墨前沿的距离为碳墨在小肠内推进的距离。与胃排空率测定实验同时检测。小肠推进率(%)=碳墨在小肠推进的距离/小肠总长度×100%。

1.6.6 一氧化氮（NO）、神经降压素（NT）实验第28天禁食12 h后，经腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，收集于空白的采血管中，静置30 min，4℃3000 r/min离心，20 min，取上清，为血清，供NO、NT检测。

1.6.7 胃窦组织形态学变化各组大鼠在造模结束后及给药干预结束后第2天，用30%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉后，采用中性甲醛，以内固定的方法固定全胃，梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色，光镜下观察胃病理学变化。

1.6.8 统计学分析实验数据运用SPSS 17.0处理，数据以均数±标准差（x±s）表示，若数据符合正态分布，方差齐，多组数据则采用参数统计的单因素方差分析(One-Way ANOVA)，两两比较采用LSD法；自身前后比较则采用配对T检验。若数据不符合正态或方差不齐，则采用非参数检验中的多个独立样本Kmskal-WallisH检验，两两比较采用SNK-q法进行统计处理。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状态观察实验前，各组大鼠精神状态良好，活泼好动，皮毛顺滑光泽，眼角口鼻干净，耳廓呈淡粉色，大便干稀适中。参与造模的大鼠，夹尾刺激后，表现为强烈的嘶叫、反抗、欲挣脱蝴蝶夹、呈激惹状态、寻衅打斗，夹尾持续15 min后嘶叫、打斗减少，大鼠或扎堆角落，或舔蝴蝶夹，但保持激惹状态，相互警惕，站立呈防御姿势，造模前7 d大鼠的激惹程度随造模时间的延长逐渐加重，并能持续至夹尾结束后。7 d后逐渐开始适应，嘶叫、打斗时间减少，平均持续不足10 min，但仍保持激惹状态。7 d后，大鼠逐渐出现精神倦怠甚至萎靡不振、易激怒、躲避、畏惧、皮毛干枯散乱无光泽、扎堆儿角落、少动、体重下降、进食减少等。

2.2 体重增长情况如表1，夹尾联合不规则喂养造模28 d后，与空白组相比，模型组大鼠体重增长缓慢，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表1 夹尾联合不规则喂养法对大鼠体重的影响（x±s，g）

2.3 糖水消耗实验如表2，夹尾联合不规则喂养法造模28 d后，与空白组相比，模型组大鼠糖水消耗减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 夹尾联合不规则喂养法对大鼠糖水消耗的影响（x±s，g）

2.4 敞箱实验(open-field法)如表3，夹尾联合不规则喂养法造模28 d后，与空白组相比，模型组大鼠活动减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表3 夹尾联合不规则喂养法对大鼠敞箱实验的影响（x±s，次）

2.5 胃内残留率测定/胃排空率测定如表4，夹尾联合不规则喂养法造模28 d后，与空白组相比，模型组大鼠胃内残留率增加/胃排空率降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表4 夹尾联合不规则喂养法对大鼠胃内残留率的影响（x±s，%）

2.6 小肠推进率测定如表5，夹尾联合不规则喂养法造模28d后，与空白组相比，模型组大鼠小肠推进率降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表5 夹尾联合不规则喂养法对大鼠小肠推进率的影响（x±s，%）

2.7 胃组织形态学变化如图，各组大鼠胃组织结构正常。粘膜上皮完整，均无充血、水肿、溃疡，无炎症细胞浸润等病理组织学改变。提示夹尾联合不规则喂养法造模大鼠胃无炎性病变。

图1 2组大鼠胃窦HE染色（×100）

3 讨论

与正常组相比，模型组大鼠精神倦怠甚至萎靡不振、易激怒、躲避、畏惧、皮毛干枯散乱无光泽、扎堆儿角落、少动、体重下降、进食减少等，体重增长缓慢，大鼠胃内残留率增加/胃排空率降低，小肠推进率降低，胃无组织形态学改变。说明夹尾联合不规则喂养法造模复制FD成功，且造模大鼠胃无炎性病变。

夹尾联合不规则喂食造模肝郁脾虚型FD动物模型成功，操作简便，无炎性改变。本实验夹尾联合不规则喂食的方法是两因素结合制备的动物模型，同时也是中医肝郁脾虚动物模型，该法造模简单，所需时间短。束缚应激结合其他方法造模能较好地模拟FD，一直是FD研究的首选。

[1]Ford AC.Eradicating Helicobacter pylori in functional dyspepsia.Gastroenterology 2012（142）:1613-1614.

[2]苏干伸.中医辨证治疗功能性消化不良40例疗效观察[J].内蒙古中医药，2010，29（14）:11-12．

[3]沈志祥，陈喜芝，谭诗云，等.消化系统疾病诊断与治疗学[M].北京:科学技术文献出版社，2004:166.

[4]徐亮，陈剑群.功能性消化不良与精神心理因素关系的研究进展[J].徐州医学院学报，2010，30(6):418.

Establishment and Evaluation of Liver and Spleen Deficiency FD Rats Model

CHEN Jie1,ZHANG Jinwei3,YANG Yan2,HU Jiangong4,LI Huizhen1,DU Xiao2,WANG Tianlin2,KONG Xiangru2
(1.Department of Gastroenterology,the Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China; 2.Graduate School,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300073,China; 3.Department of Neurology,the Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China; 4.Department of Pathology,the Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China)

ObjectiveTo establish liver stagnation and spleen deficiency type of functional dyspepsia(FD)rat model.Methods50 SD rats were randomly divided into control group,model group,medicine group and domperidone group,with 10 rats in each group.The model group used tail clamp combined with irregular feeding method to establish the rat model of FD rat.After 1/3 32mm 30min after the release,the butterfly clip,1 time a day,two,four,six week to fasting,to more than enough feed for 4 weeks.The two groups of rats general condition,body weight growth,sugar consumption test and open field test(open-field method),the gastric remnant rate determination(determination of gastric emptying rate,intestinal propulsive rate determination),nitric oxide(NO) and neurotensin(NT)and morphological changes of gastric antrum were observed and compared.ResultsThe rat had mental fatigue,slow increase of body weight,sugar consumption decreased,activity reduction,gastric emptying rate increase lower gastric emptying rate and intestinal propulsion rate decreased,and there was no inflammatory cell infiltration and other pathological changes.ConclusionThe modeling method is simple,repeatable rate is high,and it is worthy of further promotion and application.

functional dyspepsia;animal model;liver stagnation and spleen deficiency;animal experiment research

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.08.055

1672-2779（2017）-08-0132-03

张文娟 本文校对：李永成

2016-12-23）

天津市中医药管理局中医、中西医结合科研专项课题【No：13099】