超声-微波协同提取甘草渣中总黄酮工艺优化

张腊腊，胡浩斌，王宗博，郑旭东，韩明虎

（1.陇东学院化学化工学院，甘肃庆阳745000；2.庆阳市中凯农产品有限责任公司，甘肃庆阳745000）

超声-微波协同提取甘草渣中总黄酮工艺优化

张腊腊1，胡浩斌1，王宗博2，郑旭东1，韩明虎1

（1.陇东学院化学化工学院，甘肃庆阳745000；2.庆阳市中凯农产品有限责任公司，甘肃庆阳745000）

为提高甘草的综合利用，该研究以甘草渣为原料，采用响应面法优化超声-微波协同提取甘草渣中总黄酮的提取工艺条件。考察液料比、微波功率、乙醇体积分数和提取时间对甘草渣中总黄酮提取率的影响，根据响应面试验结果，建立总黄酮提取率的回归方程，获得甘草渣中总黄酮的最佳提取工艺条件为：液料比28.4∶1（mL∶g）、微波功率125 W、超声功率300 W、乙醇体积分数79%、提取时间32 min。在此条件下，甘草渣中总黄酮的提取率为2.59%。

甘草渣；总黄酮；超声-微波协同提取；响应面法

甘草在医学药典中被称为美草、灵通等，以其根茎入药可补脾益气、缓急止疼等[1]，因此被誉为中药之王[2]。甘草中主要有效成分是甘草酸和黄酮类化合物[3]。而甘草黄酮由于具有抗氧化、抗肿瘤等药理功能广泛应用于食品、药品等领域[4-5]。然而，工业化生产中只提取甘草中的甘草酸作为主要药效成分，而富含大量黄酮类化合的甘草渣则作为废料弃去，造成资源的极大浪费。

甘草黄酮的提取方法主要有溶剂提取法、超声辅助提取法、微波辅助提取法等[6-9]。溶剂提取法由于提取物中杂质多、提取时间长等因素导致提取率很低[10-12]。超声波提取由于供热不足导致提取时间过长，而微波提取又有传热、传质不均匀等缺陷，利用超声-微波协同提取则可以起到对两种方法缺陷的互补，从而缩短提取时间、提高提取效率[13]。响应面法由于操作简便、预测准确，在黄酮提取工艺优化中应用广泛[14-16]。

本研究在单因素试验的基础上，采用响应面法对超声-微波协同提取甘草渣中总黄酮的提取工艺进行优化，以期获得更为科学和合理的提取工艺，为甘草黄酮的深入研究及其在食品领域的工业化生产创造一定条件，同时还能做到资源的重复利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘草渣：庆阳市中凯农产品有限责任公司；芦丁标准品（纯度98%）：中国药品生物制品研究所；氧化铝、硅胶、乙酸乙酯、石油醚（均为分析纯）：西安化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

NJL07-5型实验室超声微波炉：南京杰全微波设备有限公司；7230G型可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；SPECORD-50型紫外分光光度仪：德国耶拿公司；RE-5203型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；FZ102型微型植物试样粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；SHZ-D型循环水式真空泵：河南省巩义市英峪仪器一厂；BS110S型电子天平：北京赛多利斯天平有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 芦丁标准曲线的绘制

精密称取105℃干燥至质量恒定的芦丁标准品0.01 g，加体积分数为80%的乙醇溶液定容至100 mL，配制成质量浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。精确吸取质量浓度为0.1mg/mL的芦丁标准溶液0、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5 mL、3.0 mL，置于10 mL试管中，分别加入体积分数为80%的乙醇溶液5.0 mL，再加0.5 mL10%KOH溶液，充分摇匀显色5 min后，用体积分数为80%的乙醇溶液定容，以不加样品的溶液为参比液，在波长410 nm处测定其吸光度值。以吸光度（A）为纵坐标，芦丁标准溶液的质量浓度（y）为横坐标，得到标准曲线回归方程为：y=32.336x-0.012 9，R2=0.994 5。样品中总黄酮质量浓度按照芦丁标准曲线回归方程进行计算。甘草渣中总黄酮提取率计算公式如下：

式中：w为总黄酮提取率，%；n为稀释倍数；V为提取液体积，mL；X为提取液中总黄酮的质量浓度，mg/mL；W为甘草渣质量，g。

1.3.2 甘草渣中总黄酮的提取单因素试验

精确称取一定量的经烘干并粉碎过筛（60目）的甘草渣粉，置于250 mL烧杯中，加入一定体积分数的乙醇溶液混合后，采用超声-微波协同提取2次：微波加热到一定温度并保持一定时间再进行超声波（300 W）辅助提取（超声提取时间为总提取时间的一半），提取一定时间后，过滤，合并收集滤液，分析其中总黄酮的质量浓度，计算提取率。固定其他条件不变，分别考察液料比（15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（mL∶g））、微波功率（90W、120W、150W、180W、210W）、乙醇体积分数（60%、70%、80%、90%、100%）和提取时间（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min）等因素对甘草渣中总黄酮提取率的影响。

1.3.3 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，固定超声波功率为300 W，选取微波功率（X1）、提取时间（X2）、液料比（X3）和乙醇体积分数（X4）为影响因素，总黄酮提取率（Y）为响应值，进行4因素3水平响应面试验分析，试验因素与水平见表1。

表1Box-Benhnken试验因素与水平Table 1 Factors and levels of the Box-Benhnken experiments

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比对甘草渣中总黄酮提取率的影响

考察液料比对甘草渣中总黄酮提取率的影响，结果如图1所示。

图1 液料比对总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of total flavones

由图1可知，当液料比从15∶1（mL∶g）增加至30∶1（mL∶g）时，随着液料比的增大甘草渣中总黄酮的提取率显著增加，这是因为随着溶剂的增加，固液两相的接触面积增大，有利于总黄酮的溶出；当液料比为30∶1（mL∶g）时提取率达到最大值，为2.45；当液料比超过30∶1（mL∶g）时，黄酮类化合物溶出的速度减慢，总黄酮提取率有所下降。因此选择最适液料比30∶1（mL∶g）为宜。

2.1.2 提取时间对甘草渣中总黄酮提取率的影响

考察提取时间对甘草渣中总黄酮提取率的影响，结果如图2所示。

图2 提取时间对总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of total flavones

由图2可知，随着提取时间的延长，总黄酮提取率呈先增加后下降的趋势，当提取时间＜30 min时，甘草渣中总黄酮的提取率随着时间增大，当提取时间＞30 min后甘草渣中总黄酮的提取率很快下降。这是因为黄酮类化合物本身容易被氧化破坏，在超声波中处理时间越长，提取率就会下降。因此选择提取时间为30 min为宜。

2.1.3 微波功率对甘草渣中总黄酮提取率的影响

考察微波功率对甘草渣总黄酮提取率的影响，结果如图3所示。

图3 微波功率对总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of microwave power on extraction rate of total flavones

由图3可知，随着微波功率的增大，总黄酮的提取率先上升后降低。因为在一定时间内，随着微波功率的增加反应温度也随之升高，分子的热运动加速，有利于总黄酮的溶出，但提取功率进一步增加，则会使温度过高导致乙醇挥发，溶剂减少，黄酮溶出量减少。因此选择提取功率为120 W为宜。

2.1.4 乙醇体积分数对甘草渣中总黄酮提取率的影响

考察乙醇体积分数对甘草渣总黄酮提取率的影响，结果如图4所示。

图4 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ethanol content on extraction rate of total flavones

由图4可知，随着乙醇体积分数的升高，总黄酮提取率呈先上升后降低的趋势。这是因为根据相似相溶原理，当乙醇体积分数为80%时，溶剂与溶质极性相似，可达到最大溶出度，因此甘草渣中总黄酮提取率达到最大，但是随着乙醇体积分数的增大，产生的渗透压也越大，其他的醇溶性物质、色素的溶出量也会增加从而导致总黄酮的提取率下降。因此选择乙醇体积分数80%为宜。

2.2 响应面优化试验结果

根据单因素试验结果，以总黄酮提取率（Y）为响应值，选取微波功率（X1）、提取时间（X2）、液料比（X3）和乙醇体积分数（X4）为影响因素，进行4因素3水平响应面试验分析，响应面优化试验设计及结果见表2，回归模型方差分析见表3。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiments

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

采用Design Expert 8.0.6软件对表2数据进行多元回归拟合处理和分析，获得甘草渣总黄酮提取率（Y）对微波功率（X1）、提取时间（X2）、液料比（X3）和乙醇体积分数（X4）的二次多元回归方程为：

由表3可知，一次项X1、X2、X3、X4和二次项X12、X22、X32、X42对响应值均呈极显著影响（P＜0.01），X1X4呈显著影响（P＜0.05），回归方程模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.591 6＞0.05），表明该回归模型预测值与实际值能较好的拟合。回归系数R2=0.980 0，表明模型相关性良好。校正决定系数Radj2=0.960 1，表明模型能解释96.01%响应值变化，试验误差较小。因此，该回归方程模型可以用于甘草渣中总黄酮提取的分析及预测。

由Design Expert 8.0.6软件处理得到的各因素互交作用的响应面分析结果见图5。

由图5可知，X1（微波功率）与X4（乙醇体积分数）交互作用等高线呈椭圆形，椭圆的轴线与X1和X4坐标轴存在一个角度。当X1比较小时，X4即提取溶剂的极性对甘草渣中总黄酮提取率的影响非常显著，表现为曲线比较陡，说明在微波功率比较低时，提高乙醇体积分数能明显提高甘草渣中总黄酮提取率；而在X4（乙醇体积分数）比较大时，微波功率对黄酮提取率影响不是很明显，表现为曲线比较平缓，即乙醇体积分数比较大时，即使提高微波功率，甘草渣中总黄酮提取率也得不到明显提高，这两个因素之间互相抑制，这与回归方程中X1X4项系数为负相符。这与方差分析交互项X1X4对甘草渣总黄酮提取率影响显著结果一致。

图5 微波功率、提取时间、液料比和乙醇体积分数交互作用对甘草渣中总黄酮提取率影响的响应面及等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of interaction impact from microwave power,extraction time,liquid-solid ratio and ethanol content on extraction rate of total flavones in glycyrrhiza residue

经响应面分析得甘草渣中总黄酮的超声-微波协同提取最佳工艺为：液料比28.35∶1（mL∶g）、提取时间32.32 min、微波功率124.83 W、乙醇体积分数79.24%，在此条件下甘草渣中总黄酮的提取率理论值为2.60%。

2.3 验证试验

为了检验试验结果与真实情况的一致性，根据响应面设计法优化的结果，将最佳提取条件预测值修正为液料比28.4∶1（mL∶g）、提取时间32 min、微波功率125 W、乙醇体积分数79%。在修正后的最佳提取条件下，进行3次验证试验，实际测定的甘草渣中总黄酮的平均提取率为2.59%，与理论值（2.60%）相差不大。说明响应面优化的甘草渣中总黄酮提取工艺条件是准确可靠的。

3 结论

本研究采用超声-微波协同提取甘草渣中总黄酮，在单因素试验的基础上，通过响应面法优化提取工艺，经回归分析并结合实际操作确定最佳提取工艺为：液料比28.4∶1（mL∶g）、提取时间32min、超声功率300W、微波功率125W、乙醇体积分数79%。在此工艺条件下，甘草渣中总黄酮的提取率为2.59%。通过超声波振荡和微波热效应的结合，缩短了提取时间，提高了甘草渣中总黄酮提取率，对甘草的综合利用和资源的循环利用都具有一定的理论指导意义。

[1]郑虎占，董泽宏，余靖.中药现代研究与应用[M].北京：学苑出版社，1999，1256-1279.

[2]谷会岩.中国甘草资源生态学研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2001：5-10.

[3]崔永明.甘草次生代谢产物分离纯化研究[D].武汉：华中科技大学，2005.

[4]赵虹，蒋江涛，郑秋生，等.甘草查尔酮A药理作用研究进展[J].中国中药杂志，2013，38（22）：3814-3818.

[5]吴碧华，龙存国，王晓明，等.甘草总黄酮清除羟自由基作用的体外实验探讨[J].川北医学院学报，2001，16（3）：3-5.

[6]吴伟康，奉建芳，黄小蕊，等.甘草提取工艺的初步研究[J].中草药，2001，32（3）：211-212.

[7]李炳奇，汪河滨，李学禹，等.超声法联合提取甘草黄酮和甘草酸的研究[J].山东中医杂志，2005，24（1）：38-40.

[8]杨慧.对甘草中总黄酮提取工艺的研究[D].南昌：南昌大学，2013.

[9]刘晓风，相炎红，张百刚，等.甘草黄酮的提取工艺研究[J].安徽农业科学，2009，37（6）：2542-2543.

[10]封士兰.甘草黄酮的提取分离和含量测定[J].兰州医学院学报，1998，24（4）：20-21.

[11]罗锋，王咏梅，舒尊哲，等.甘草黄酮的提取及影响活性因素研究[J].四川师范大学学报，2006，29（5）：613-615.

[12]邓引梅，崔永明，宋发军，等.响应面法优化闪式提取甘草叶总黄酮工艺研究[J].化学与生物工程，2008，25（9）：44-47.

[13]CHEN Y Y,GU X H,HUANG S Q,et al.Optimization of ultrasonic/ microwave assisted extraction(UMAE)of polysaccharides fromInonotus obliquusand evaluation of its anti-tumor activities[J].Int J Biol Macromol,2010,46(4):429-435.

[14]ZHANG Z,ZHENG H.Optimization for decolorization of azo dye acid green 20 by ultrasound and H2O2using response surface methodology[J]. J Hazard Mater,2009,172(2):1388-1393.

[15]何自强，张惠玲，高永诚.响应面Box-Behnken设计优化超声波辅助法提取甘草总黄酮的工艺研究[J].北京化工大学学报：自然科学版，2016，43（4）：66-72.

[16]贺寅，王强，钟葵.响应面优化酶法提取龙眼多糖工艺[J].食品科学，2011，32（2）：79-83.

Optimization of extraction technology of total flavones from glycyrrhiza residue by microwave-ultrasound assisted method

ZHANG Lala1,HU Haobin1,WANG Zongbo2,ZHENG Xudong1,HAN Minghu1
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Longdong University,Qingyang 745000,China; 2.Qingyang Zhongkai Agricultural Products Limited Liability Company,Qingyang 745000,China)

In order to improve the comprehensive utilization of glycyrrhiza,using glycyrrhiza residue as raw material,the microwave-ultrasound assisted extraction process conditions of total flavones from glycyrrhiza residue were optimized by response surface method.The effects of liquidsolid ratio,microwave power,ethanol content and extraction time on total flavones extraction rate in glycyrrhiza residue were investigated.According to the response surface experiments results,the regression equation of total flavones extraction rate was established.The optimum extraction conditions of total flavones in glycyrrhiza residue were liquid-solid ratio 28.4∶1(ml∶g),microwave power 125 W,ultrasonic power 300 W,ethanol content 79%and extraction time 32 min.Under the conditions,the extraction rate of total flavones in glycyrrhiza residue was 2.59%.

glycyrrhiza residue;total flavones;microwave-ultrasound assisted extraction method;response surface methodology

TS209

0254-5071（2017）04-0163-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.034

2016-12-28

甘肃省科技支撑项目（1604NKCM082）；甘肃省应用化学省级重点学科建设项目（GSACK20130113）

张腊腊（1986-），女，讲师，硕士，研究方向为天然产物提取加工。