环境因素对屎肠球菌产酪胺的影响

王俊朋，吕晓玲，张颖，朱晓娟，张健*

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院食品营养与安全教育部重点实验室，天津300457；2.工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457）

环境因素对屎肠球菌产酪胺的影响

王俊朋1，吕晓玲1，张颖1，朱晓娟2，张健2*

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院食品营养与安全教育部重点实验室，天津300457；2.工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457）

酪胺是发酵食品中广泛存在的、毒性较强的一种生物胺。屎肠球菌作为发酵剂或污染菌广泛存在于发酵食品中，大多数具有产生酪胺的能力，成为发酵食品的潜在安全隐患。该研究以一株黄酒酒曲中分离的产酪胺屎肠球菌为对象，选取葡萄糖、酪氨酸、温度、pH值和酒精含量5个因素，研究这些因素对该菌生长和酪胺合成的影响。结果表明，葡萄糖或酪氨酸添加量对菌体的生长影响不大，温度、环境pH值和酒精含量对菌体生长的影响较显著。酪氨酸对菌体产酪胺促进作用明显，温度＜20℃，环境pH值＞5，酒精含量＞10%vol时都会减少酪胺的产生。

屎肠球菌；酪胺；环境因素；菌体生长；黄酒

生物胺是一类含氮的具有生物活性的小分子量有机化合物的总称。根据结构可以将其分成三类：脂肪族（如腐胺，尸胺、精胺、亚精胺等）；芳香族（如章鱼胺、酪胺、苯乙胺等）；杂环族（如组胺、色胺等[1]）。适量的生物胺在生物体内具有重要的生理作用，但是当人体吸收过量的生物胺时，将产生一系列应激反应，甚至死亡。

黄酒是我国特有的传统酒种，开放式多菌种发酵方式使其中生物胺含量远高于葡萄酒或啤酒等其它发酵酒。虽然，目前没有黄酒中生物胺的限量标准，但是很多学者建议酒精饮料中组胺的中毒剂量为8～20 mg/L，酪胺的中毒剂量为25～40 mg/L[2-7]。前期调研以及文献报道表明，很多黄酒产品中的酪胺含量高于此标准，这使得黄酒的饮用安全受到一些质疑，影响了黄酒产品的推广和出口创汇。

酪胺是黄酒中的主要生物胺之一，也是毒性仅次于组胺的生物胺，在人体内大量积累会引起偏头痛和高血压，严重时会导致脑溢血。酪胺是由酪氨酸脱羧酶将酪氨酸脱羧转化而成的，酪氨酸脱羧酶广泛存在于肠球菌属细菌中[5]，因此肠球菌属细菌是最常见的酪胺产生菌。本实验室前期从黄酒酒曲中分离鉴定了一株屎肠球菌（Enterococcus faecalis），具有很强的酪胺合成能力。前期，也有学者从发酵肉制品、奶酪等产品中分离到了产酪胺的屎肠球菌。

通常认为，屎肠球菌是肠系菌群平衡的关键菌株，具有较好的抑菌效果和降胆固醇等益生功能，同时也在很多发酵食品的成熟和风味形成中发挥重要作用[6]。同时，一些屎肠球菌也被医院公认为是引起血症、心内膜炎、泌尿道和其他感染的病原体[8-10]。由于这些菌株可以生存在高盐浓度，低pH值和高温的环境中，在食品加工过程中很难完全灭活[11-12]。

鉴于屎肠球菌在众多发酵制品中的重要作用，有必要深入研究环境因素对该菌种合成酪胺的影响。为此，本试验选取葡萄糖、酪氨酸、温度、pH值和酒精含量5个因素，结合黄酒发酵过程设置不同水平，研究这些环境因素对屎肠球菌生长和酪胺合成的影响。真实的黄酒发酵过程是多菌种开放式发酵[13-14]，其中酪胺的形成除与上述因素有关，还受原料、菌群互相作用等因素的影响，且黄酒中存在多种酪胺产生菌，酪胺的形成非常复杂。因此本研究并不能完全反映黄酒发酵过程中环境因素对酪胺形成的影响，但是可为屎肠球菌为主要发酵菌种生成酪胺的过程提供一些基础参数，有助于理解黄酒发酵过程中酪胺的形成。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

屎肠球菌（Enterococcus faecalis）：从黄酒酒曲中分离。

乙腈（色谱纯）：东莞市乔科化学有限公司；酪胺标准品：天津一方科技有限公司；其他试剂为国产分析纯。

MRS液体培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母提取物4g/L，葡萄糖20g/L，乙酸钠·3H2O 5 g/L，吐温80 1 mL/L，磷酸氢二钾2 g/L，柠檬酸三胺2 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，酪氨酸0.5 g/L。

1.2 仪器与设备

Essentia PrepLC-16P高效液相色谱仪：日本岛津公司；756PC紫外分光光度计：上海光谱仪器有限公司；BCD-257SL冰箱：青岛海尔有限股份公司；REGEND MICRO 17R小型高速离心机：美国Thermo公司；QL-901涡旋混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；HH-B11-BY恒温培养箱：上海跃进医疗有限公司；SY-1-2恒温水浴锅：天津市欧诺仪器仪表有限公司；KQ-500DE超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；CP64电子分析天平（精确至0.0001g）：奥豪斯仪器有限公司；Sartorius普及型pH计：Sartorius；0.45 μm针头微孔滤膜过滤器：北京华盛鼎国科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培养条件

研究过程所用培养基是在MRS液体培养基加入0.05%的酪氨酸基础上稍加修改，使研究的因素为液体培养基的单一变量。30℃条件下恒温培养24 h，每4 h取样。所有试验的培养基的pH值控制在6.15～6.20范围内。

因素水平为：（1）葡萄糖的添加量（5g/L、10g/L、15g/L、20 g/L）；（2）酪氨酸的添加量（0.2 g/L、0.5 g/L、0.8 g/L）；（3）温度（20℃、25℃、30℃、35℃）；（4）pH值（4.5、5.0、5.5、6.2）；（5）酒精含量（0、5%vol、8%vol、10%vol）。

相应的液体培养基（10 mL MRS培养基加入0.05%的酪氨酸）接种体积分数1%的菌悬液，用试管在30℃条件下培养24 h，每4 h取样，每组实验设3个平行，在不同环境条件下培养之后，分别测定菌体的OD600nm值和酪胺产量。实验技术路线如下：

菌体活化→制备菌悬液→接种菌悬液到不同因素水平的培养基进行恒温培养→测定菌体OD600nm→测定发酵液中的酪胺含量

1.3.2 菌体生长曲线的测定

用分光光度法在波长600 nm处分别每4 h测定菌体OD值，当OD值＞0.7时样液将被稀释2～3倍，最后的吸光度值为测定值乘以稀释倍数。

1.3.3 酪胺含量的测定

（1）生物胺的衍生

取发酵液1 mL置于10 mL的离心管中，加入1 mL饱和碳酸氢钠溶液，加1 mol/L氢氧化钠溶液调至pH 10，1 mL丹磺酰氯衍生溶液，振荡混匀，置60℃水浴锅内反应30 min，中间振荡两次，取出，加入100 μL氨水，振荡混匀，60℃水浴锅内反应30min，取出在40℃水浴下氮吹除去丙酮，加入3 mL乙醚振荡2 min，静置分层，吸取上清有机层，重复萃取两边，合并乙醚萃取液，氮气吹干。加入1 mL乙腈使残留物溶解，振荡混匀，0.22 μm滤膜针头过滤，滤液待测。

（2）高效液相色谱测定

液相色谱参考条件色谱柱为Gemini 5u C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）柱，紫外检测波长254 nm，进样量20 μL，柱温30℃，流动相A为超纯水，流动相B为乙腈溶液，流速1 mL/min，按外标法以峰面积计算样品的含量。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution programs

2 结果与分析

2.1 酪胺标准曲线的制作以及衍生物色谱图的绘制

吸取0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.50 mL、5.00 mL酪胺标品（100 mg/L），分别置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，混匀，配制成一定浓度梯度的标准品，分别吸取上述标准系列和试样的衍生溶液注入高效液相色谱仪中测定峰面积，以酪胺质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线，酪胺标准曲线见图1，记录色谱图，酪胺衍生物的色谱图见图2。由图1可知，标准曲线为y=130 000x+43 047，R2=0.999。由图2可知，酪胺的保留时间约为17.0 min。

图1 酪胺标准曲线Fig.1 Standard curve of tyramine

图2 酪胺衍生物的高效液相色谱图Fig.2 HPLC of tyramine derivative

2.2 不同环境因素对菌体生长及产酪胺的影响

葡萄糖作为碳源是为微生物的生长繁殖提供提供营养物质和能量来源，氮源是生长过程中给微生物提供氮元素的物质，这些营养条件直接影响着菌体的生长繁殖，除此之外的发酵条件温度、pH、酒精等对菌体的生长也有抑制或者促进作用。不同因素水平条件对屎肠球菌（E.faecalis）生长的影响见图3。

由图3可知，葡萄糖和酪氨酸的添加量对菌体生长动力学的影响不大，生长12 h均可达到稳定期，且培养24 h，OD值均可达到2.2左右；酒精含量对菌体生长抑制显著，当酒精度＞8%vol时菌体生长几乎停止；pH值对菌体生长动力学有显著影响，pH值为4.5～6.2时菌体的生长速度明显变快，稳定期的最大菌密度也呈现增加趋势。在pH值4.5时菌体生长停止生长；温度显著影响菌体生长，随着培养温度的升高菌密度和生长速度都呈现增长趋势。

酪胺是由酪氨酸脱羧酶催化转化产生的。环境因素不仅对菌体生长有影响，还会影响菌体的产酶量以及酶的催化活性。这些都会影响发酵液中的酪胺含量。环境因素对发酵液中的酪胺含量的影响如图4所示。

图3 不同环境因素对屎肠球菌生长的影响Fig.3 Effect of different environmental factors onE.faecalisgrowth

图4 不同环境因素对屎肠球菌产酪胺的影响Fig.4 Effect of different environmental factors on tyramine production byE.faecalis

由图4可知，高含量的葡萄糖会导致稳定期后期酪胺的大幅减少，BUNKOVA L等[6]认为可能是由于在稳定期后期微生物代谢大量产酸抑制了菌体的生长，导致产胺量降低。但结合图3a可知本实验条件不会抑制菌体的生长，因此酪胺含量降低可能与产酶量减少或产酸导致酪氨酸脱羧酶活性降低所致；酪氨酸添加量不会改变酪胺的形成规律，即酪胺在8 h产量最高，随后逐渐降低。但是随着酪氨酸含量的增多，酪胺产量呈现递增趋势，酪氨酸的前体作用非常明显。这与LINARES D M等[20]的报道一致；酒精含量＞8%vol时菌体几乎停止生长，因此几乎也无酪胺生成。但与添加5%vol的酒精相比不添加酒精生成的酪胺更多，即如图3c所示不添加酒精更有利于菌体的生长。这说明少量的酒精对产酶或酶活有促进作用。pH4.5时酪胺产量随时间呈现逐渐增加的趋势，而如图3d所示，此pH条件下菌体几乎不能生长。酪胺的逐渐积累可能与酸性条件诱导菌体产酶有关，PEREZ M等[21]也有过类似的报道。中性条件下酪胺的含量并非最高，这也印证了酸性条件有利于菌体产酶。图4e温度对酪胺的影响主要体现在菌体的对数生长期，这个时期温度越高酪胺的合成速度越快，产量也越高；但是培养24 h后，温度对酪胺含量几乎无影响。

3 结论

总体而言，葡萄糖或酪氨酸添加量对菌体的生长影响不大，温度、pH值和酒精含量对菌体生长的影响较显著。酪氨酸对菌体产酪胺促进作用明显。温度低于20℃，环境pH值＞5，酒精含量＞10%vol都会抑制酪胺的生成。由图可知显然菌体生长和酪胺的产生并非简单的对应关系。酪胺的合成还受酪氨酸脱羧酶的产量和酶活的双重影响。进一步对产酶量和酶活的研究将更为清晰的揭示环境条件对屎肠球菌（Enterococcus faecalis）合成酪胺的影响。本研究并不能完全反映黄酒发酵过程中环境因素对酪胺形成的影响，但是可为屎肠球菌为主要发酵菌种合成酪胺的过程提供一些基础参数，这有助于理解黄酒发酵过程中酪胺的形成。

参看文献：

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Effect of environmental factors on tyramine production byEnterococcus faecalis

WANG Junpeng1,LV Xiaoling1,ZHANG Ying1,ZHU Xiaojuan2,ZHANG Jian2*
(1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education,College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China;2.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education,College of Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China)

Tyramine is a kind of strong toxic biogenic amines widely existed in fermented food.Enterococcus faecalis,as fermentation starter or contamination bacteria,is widely existed in fermented food,and most of them have the ability to produce tyrosine,which became potential safety hazard of fermented food.In the paper,using tyramine producing byE.faecalisisolated from Chinese rice wine as research objest,the effect of five factors including glucose,tyrosine,temperature,pH and alcohol content onE.faecalisgrowth and tyramine production was studied.Results showed that glucose or tyrosine addition had little effect on cell growth,while temperature,pH and alcohol content had significant effect on cell growth.Tyrosine can promote tyramine production apparently and tyramine production can be reduced under the condition of temperature＜20℃,or environment pH＞5,or alcohol content＞10%vol.

Enterococcus faecalis;tyramine;environmental factors;cell growth;Chinese rice wine

TS201.1

0254-5071（2017）04-0040-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.009

2016-12-05

国家自然科学基金资助项目（31471725）

王俊朋（1990-），男，硕士研究生，研究方向为食品添加剂与功能性配料。

*通讯作者：张健（1978-），男，副研究员，博士，研究方向为发酵食品安全。