胆管细胞癌细胞CD147表达及其临床意义*

易为民，彭 创，厉 鸥，郭 超，顾 鑫，谭朝霞

胆管细胞癌细胞CD147表达及其临床意义*

易为民，彭 创，厉 鸥，郭 超，顾 鑫，谭朝霞

目的 探讨CD147在肝胆管结石并发胆管细胞癌（ICC）组织的表达及其临床意义。方法收集肝胆管结石并发ICC标本30例、对应的癌旁肝组织标本30例和正常肝标本10例。采用qRT-PCR法检测组织CD147 mRNA水平，采用免疫组化法检测CD147蛋白的表达；采用Western-Blotting法检测基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和9（MMP-9）蛋白的表达；采用肯德尔（Kendall）等级相关分析CD147 mRNA、CD147、MMP-2和MMP-9表达的相关性。结果经qRT-PCR检测显示，肝胆管结石并发ICC组织CD147mRNA水平为（3.67±1.88），显著高于癌旁组织【（1.52±0.57），P＜0.01】和正常肝组织【（1.05±0.32），P＜0.01】，癌旁组织高于正常肝组织（P＜0.01）；＞5 cm ICC组织CD147 mRNA相对水平（2.73±0.97）显著高于＜5 cm肿瘤组织【（1.03±0.32），P＜0.01】，有淋巴转移（2.68±0.74）组织显著高于无转移组织【（1.07±0.44），P＜0.01】，肿瘤分化程度低组织（2.71±0.86）显著高于中高分化组织【（1.06± 0.42），P＜0.01】；不同年龄和性别患者ICC组织CD147 mRNA水平无显著性差异（P＞0.05)；经免疫组化检测显示，肝胆管结石并发ICC组织CD147蛋白表达相对水平为（27.95±4.90），显著高于癌旁组织【（13.34±9.59），P＜0.01】和正常肝组织【（2.18±0.66），P＜0.01】，而癌旁组织高于正常肝组织（P＜0.01）；ICC组织MMP2表达量为（1.06±0.13），显著高于癌旁组织【（0.20±0.03），P＜0.01】和正常肝组织【（0.15±0.02），P＜0.01】，而癌旁组织MMP2表达量显著高于正常肝组织（P＜0.01）；肝胆管结石并发ICC组织MMP9表达量为（0.93±0.12），显著高于癌旁组织【（0.17±0.03），P＜0.01】和正常肝组织【（0.15±0.03），P＜0.01】，而癌旁组织MMP9表达量显著高于正常肝组织（P＜0.01）；在ICC组织中，CD147mRNA水平与MMP2蛋白表达呈正相关（r=0.457，P＜0.05）；CD147mRNA水平与MMP9蛋白表达也呈正相关（r=0.428，P＜0.05）；CD147蛋白与MMP2蛋白表达呈正相关（r=0.543，P＜0.05），CD147蛋白与MMP9蛋白表达也呈正相关（r=0.517，P=0.05）。结论CD147 mRNA、CD147、MMP2、MMP9均在肝胆管结石并发ICC组织中表达增强，CD147的表达可能促进了MMP2和MMP9的表达上调，它们可能共同参与了胆管癌的发生和发展过程。

胆管细胞癌；CD147；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶-9

肝内胆管细胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）的早期发现率极低，就诊时多数ICC患者已处于晚期，导致其手术切除率较低，疗效差。近年来，国内外有关肝胆管结石合并ICC的文献报道有逐年增多的趋势[1]。随着基因靶向治疗技术的兴起，采用基因靶向治疗ICC的技术也越来越多的受到关注[2～4]。CD147是一种细胞表面粘附分子，也被称作细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN），是一种具有高度糖基化、普遍表达于细胞系统等特点的跨膜糖蛋白，存在于多种肿瘤细胞中。肿瘤浸润转移过程包括基底膜的降解、基质渗透和继发性生长等多个环节。肿瘤细胞和宿主间质细胞在整个浸润转移过程中相互作用，可能受到CD147分子刺激产生的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）的影响，从而促进细胞基底膜及间质成分的降解，对肿瘤细胞的浸润和转移起到重要作用[5～7]。目前，国内外有关ICC细胞CD147表达情况及CD147与MMPs的关系方面的研究仍然较少。本文探讨了CD147mRNA、CD147蛋白、MMP2、MMP9在肝胆管结石并发ICC组织的表达情况，以及它们与患者临床病理学指标的关系，为进一步研究以CD147为靶点的治疗方法打下基础。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2013年3月～2013年12月在湖南省人民医院肝胆外科行手术切除的30例（男性18例，女性12例，年龄在37～77岁，平均年龄为56± 12岁）肝胆管结石并发ICC患者的癌组织及其对应的距离肿瘤组织边缘2 cm的肝组织（经病理学检查证实无癌细胞），其中高分化腺癌4例，中分化腺癌7例，低分化腺癌19例；无淋巴结转移13例，有转移者17例；肿瘤直径＜5 cm者9例，＞5 cm者21例。另取10例正常肝组织（肝破裂、肝血管瘤等良性病变行肝脏切除术获得）。本组所有患者在术前均未进行过放、化疗等特殊治疗。组织置入无菌冻存管，经由液氮罐后，及时转移至-80℃冰箱保存。

1.2 肝组织有关核酸及其蛋白检测 采用实时定量PCR法（quantitive real-time PCR,qRT-PCR）检测CD147 mRNA水平（英国Abcam公司）；采用免疫组化技术检测CD147蛋白表达（英国Abcam公司）；采用Western blot法检测MMP-2和MMP-9蛋白表达（美国PTG公司）。应用美国加州Adobe公司的专业图像软件Adobe PhotoShop CS4测量免疫荧光检测结果的图像灰度值。每个样本取三个视野，因所有免疫组化检测图片的面积、高度、宽度、比例均相同，因此使用灰度值的平均值表示每个免疫荧光图片内CD147蛋白的相对表达量，再求出每个样本三个视野图片平均灰度值的均值作为该样本的最终相对表达量。免疫印迹法检测结果以目的蛋白与GAPDH内参蛋白的累积光密度参考值（IOD）比值表示。

1.3 统计分析 应用IBM SPSS 18.0统计软件，因CD147 mRNA水平资料方差不齐,采用非参数检验（Tamhane's T2）分析。计量资料以±s表示，对不同年龄、性别、肿块大小、是否有淋巴转移和TNM分期患者的资料行两独立样本的t检验。采用肯德尔（Kendall）等级相关分析MMP2蛋白、MMP9蛋白、CD147mRNA和CD147蛋白水平的相关性。P＜0.05则被认为有统计学差异。

2 结果

2.1 各组 CD147 mRNA水平比较 ICC组织CD147mRNA水平为（3.67±1.88），显著高于癌旁组织【（1.52±0.57），P＜0.01】和正常肝组织【（1.05± 0.32），P＜0.01】，癌旁组织高于正常肝组织（P＜0.01）。不同特征癌组织CD147mRNA水平比较见表1。

表1 不同特征ICC组织CD147 mRNA水平（±s）比较

表1 不同特征ICC组织CD147 mRNA水平（±s）比较

例数 CD147mRNA t/x2 P性别 男 18 1.13±0.51 1.76 0.08女 12 0.93±0.57年龄（岁） >56 17 1.15±0.61 0.03 0.98 <56 13 1.15±0.58肿块（cm） >5 21 2.73±0.97 12.35 0.00 <5 9 1.03±0.32分化 低 19 2.71±0.86 12.24 0.00中高 11 1.06±0.42淋巴转移 有 17 2.68±0.74 12.82 0.00无 13 1.07±0.44

2.2 各组CD147蛋白表达情况的比较 ICC组织CD147蛋白表达相对水平为（27.95±4.90），显著高于癌旁组织【（13.34±9.59），P＜0.01】和正常肝组织【（2.18±0.66），P＜0.01】，而癌旁组织高于正常肝组织（P＜0.01）。不同特征癌组织CD147相对表达水平比较见表2。

表2 不同特征ICC组织CD147水平（±s）比较

表2 不同特征ICC组织CD147水平（±s）比较

例数 CD147蛋白 t/x2 P性别 男 18 28.56±3.99 0.84 0.41女 12 27.03±6.10年龄（岁） >56 17 28.18±5.66 0.29 0.77 <56 13 27.65±3.89肿块（cm） >5 21 29.68±4.74 4.56 0.00 <5 9 23.91±2.19分化 低 19 30.35±4.58 5.72 0.00中高 11 23.81±1.49淋巴转移 有 17 30.88±4.54 5.69 0.00无 13 24.12±1.60

2.3 各组MMP2和MMP9蛋白表达水平比较 ICC组织MMP2表达量为（1.06±0.13），显著高于癌旁组织【（0.20±0.03），P＜0.01】和正常肝组织【（0.15± 0.02），P＜0.01】，而癌旁组织MMP2表达量显著高于正常肝组织（P＜0.01）；肝胆管结石并发ICC组织MMP9表达量为（0.93±0.12），显著高于癌旁组织【（0.17±0.03），P＜0.01】和正常肝组织【（0.15± 0.03），P＜0.01】，而癌旁组织MMP9表达量显著高于正常肝组织（P＜0.01）。

2.4 相关性分析情况 在ICC组织中，CD147mRNA水平与MMP2蛋白表达呈正相关（r=0.457，P＜0.05）；CD147mRNA水平与MMP9蛋白表达也呈正相关（r=0.428，P＜0.05）；CD147蛋白与MMP2蛋白表达呈正相关（r=0.543，P＜0.05），CD147蛋白与MMP9蛋白表达也呈正相关（r=0.517，P=0.05）。综合上述结果，可以认为CD147mRNA、CD147、MMP2、MMP9在同一组织中的表达呈正相关。

3 讨论

ICC是胆道外科最常见的恶性肿瘤之一[8]，是指发生在二级胆管或二级胆管以上部位的胆管细胞癌。有些学者提出，胆管细胞癌发生的主要病因之一有可能是肝胆管结石的存在。结石能持续对胆管的内壁造成机械性的刺激，结石对胆管的堵塞导致胆汁长期排出受阻，胆汁中的一些化学物质的致癌作用也能引起胆管细胞癌的发生[9]。另一个重要的证据是许多临床手术切除标本中都能见到胆管细胞癌中存在胆管结石，并且多数患者均有长期的胆道结石病手术史，表现为胆管结石导致胆管炎症反复发作。因胆管细胞癌早期的发现率极低，就诊时多数患者已处在了晚期，导致其手术切除率较低，疗效差[10]。随着近些年来基因靶向治疗技术的兴起以及对胆管细胞癌认识的不断深入，采用基因靶向技术的方法治疗胆管细胞癌受到了人们的关注[11～13]。

CD147是一种相对分子量约为58 KDa的单链跨膜糖蛋白，隶属于免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白（immumoglobulin superfaminly，IGSF），它又被称为EMMPRIN。在人体众多的组织细胞膜表面存在CD147分子。学者们研究发现，多种恶性肿瘤细胞中可见CD147高表达，并且CD147与肿瘤的生长增殖、转移和浸润有密切的关系[14,15]。

在肿瘤的发生、发展过程中，最重要的过程就是肿瘤的浸润、转移。肿瘤细胞要转移浸润首先需要突破肿瘤细胞基底膜的束缚，向基底膜外渗透。MMPs是一类锌离子依赖的蛋白酶家族，在肿瘤的侵袭、突破基底膜的过程中，由于MMPs作为蛋白水解酶，其底物的广谱性而尤显重要。有研究表明，CD147的高表达能够诱导成纤维细胞生成MMPs增加，而MMPs是肿瘤细胞浸润降解细胞外基质过程中最重要的因子，从而导致细胞外生长因子大量释放，促进肿瘤的继发性生长和转移[16～18]。

本实验采用qRT-PCR法检测肝胆管结石并发ICC组织、癌旁组织和正常肝组织CD147 mRNA水平，并采用免疫荧光法检测ICC组织、癌旁组织和正常肝组织CD147蛋白的表达，来了解CD147在癌发生中的作用。我们发现，ICC组织CD147表达量高于癌旁组织和正常肝组织，而癌旁组织CD147表达量又高于正常肝组织。CD147的表达在胆管细胞癌肿块增大、淋巴结有转移、肿瘤分化程度低恶性程度高的胆管细胞癌组织上调，而不同年龄和性别患者，CD147的表达无显著差异，提示CD147在胆管细胞癌的生长、转移过程中可能有较为重要的作用。

CD147有可能通过促进MMPs的分泌，促进恶性肿瘤细胞的转移。本研究为了探索ICC组织CD147和MMPs的作用，采用Western blot法检测ICC组织、癌旁组织和正常肝组织MMP2和MMP9的表达情况，发现ICC组织MMP2和MMP9表达量显著高于癌旁组织和正常肝组织，癌旁组织MMP2和MMP9表达量也显著高于正常肝组织。通过对检测结果数据进行统计学分析发现，CD147 mRNA、CD147、MMP2、MMP9在同一组织中的表达呈正相关。据此，我们可以推测CD147的表达可能促进了MMP2和MMP9表达上调，它们三者共同促进胆管细胞癌细胞的生长、浸润、转移和侵袭。

根据本实验的结果，我们下一步将通过应用反义核酸技术观察抑制ICC细胞株CD147蛋白表达[19]是否能引起ICC细胞凋亡，以进一步研究以CD147分子为靶点[20]的治疗肝胆管结石并发ICC患者的可行性，为开发以CD147分子为靶点的药物并应用于肝胆管结石并发ICC的治疗打下基础。

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（收稿：2016-08-04）

（本文编辑：陈从新）

Expression ofCD147 and itsclinicalsignificancein patientswith intrahepaticcholangiocarcinoma complicating intrahepatic bile duct stones

Yi Weimin，Peng Chuang，Li Ou，et al.Department of Hepatobiliary Surgery，Provincial People’s Hospital，Changsha 410005，Hunan Province，China

ObjectiveTo investigate the expression of CD147 in intrahepatic cholangiocarcinoma（ICC）and its clinical significance.Methods 30 ICC samples with hepatolithiasis，corresponding paracancerous tissues and 10 normal liver tissues were collected in our hospital.The CD147 mRNA in liver tissues was detected by qRT-PCR，and the expression of CD147 protein was detected by immunohistochemical staining.The expression of matrix metalloproteinase-2（MMP-2）and 9 （MMP-9）protein were detected by Western blotting.The correlation of CD147 mRNA，CD147，MMP-2 and MMP-9 expression was analyzed by Kendall.Results qRT-PCR detection showed that CD147 mRNA level in ICC tissues was（3.67±1.88），much higher than in their corresponding paracancerous tissues【（1.52±0.57），P＜0.01】or normal liver tissues【（1.05±0.32），P＜0.01】，and there was a significant difference between paracancerous tissues and normal liver tissues（P＜0.01）；the relative CD147 mRNA level in＞5 cm ICC（2.73±0.97）was much higher than in＜5 cm ICC tissues【（1.03±0.32），P＜0.01】，with lymph node metastasis（2.68±0.74）was much higher than ICC without【（1.07±0.44），P＜0.01】，and in ICC with lower differentiation（2.71±0.86）was much higher than in with high differentiation【（1.06±0.42），P＜0.01】；there was no significant difference between young and elderly or male and female patients（P＞0.05）;immunohistochemical staining detection showed the CD147 protein expression in ICC tissues was（27.95±4.90），much higherthan inparacancerous tissues【（13.34±9.59），P＜0.01】or normal liver tissues【（2.18±0.66），P＜0.01】，and there was a significant difference between paracancerous tissues and normal liver tissues（P＜0.01）；the MMP2 expression in ICC tissues was（1.06±0.13），much higher than in paracancerous tissues【（0.20±0.03），P＜0.01】or normal liver tissues【（0.15±0.02），P＜0.01】，and there was also a significant difference between paracancerous tissues and normal liver tissues（P＜0.01）；the MMP9 expression in ICC was（0.93±0.12），much higher than in paracancerous tissues【（0.17±0.03），P＜0.01】or normal liver tissues 【（0.15±0.03），P＜0.01】，and there was a significant difference between paracancerous tissues and normal liver tissues（P＜0.01）；the CD147mRNA levels in ICC was positively correlated to MMP2 expression（r=0.457，P＜0.05），CD147mRNA positively to MMP9 expression（r=0.428，P＜0.05），CD147 protein expression positivelytoMMP2 expression（r=0.543，P＜0.05），and CD147 positivelytoMMP9 expression（r=0.517，P=0.05）.Conclusions There is a phenomenon of increased CD147 mRNA levels and enhanced expression of MMP2 and MMP9 in ICC tissues，which might promote the carcinogenesis，tumor growth，lymph node metastasis，and the lower tumor differentiation.

Intrahepatic cholangiocarcinoma；CD147；Matrix metalloproteinase-2；Matrix metalloproteinase-2

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.01.025

湖南省科学技术厅科技计划资助项目（编号：2012FJ4105）

410005长沙市 湖南省人民医院肝胆外科

易为民，男，45岁，医学博士，主任医师。主要从事肝胆胰肿瘤诊断和治疗学研究。E-mail：ywm8012@sohu.com