布比卡因对于大肠癌细胞的体外抑制作用

李天慈，方爱莉，韩冲芳，杨文曲，贺建东

（1.山西医科大学麻醉学系，山西 太原 030032；2.山西医学科学院•山西大医院麻醉科，山西 太原 030032）

布比卡因对于大肠癌细胞的体外抑制作用

李天慈1，方爱莉2，韩冲芳2*，杨文曲2，贺建东2

（1.山西医科大学麻醉学系，山西 太原 030032；2.山西医学科学院•山西大医院麻醉科，山西 太原 030032）

目的探讨局麻药布比卡因对大肠癌细胞的体外抑制作用。方法体外培养人结肠癌细胞Caco2，随机分为不做处理的空白组（N组），经1 mM DPBS处理24 h的溶剂对照组（V组）以及经1 mM布比卡因处理24 h的实验组（B组）。本实验通过Ki67表达水平测定癌细胞增殖能力，通过MTT实验检测细胞存活率，并通过Western blot法测量凋亡蛋白caspase3以探寻局麻药是否可以在体外培养条件下对癌细胞活性起直接抑制作用。结果在大肠癌细胞中，1mM布比卡因对癌细胞的增殖抑制作用显著，差异有统计学意义（P＜0.05）。但并未引发癌细胞的凋亡。结论实验数据表明布比卡因不利于大肠腺癌细胞存活。然而基于体外细胞培养的特殊性，此抑制作用需要更多相关的在体实验和临床实验去验证。

局麻药；大肠癌

癌症作为世界最致命的疾病之一，在2012年造成全球820万人死亡，预计2025年将有1930万新增病例（世界卫生组织，2015）。然而因肿瘤的具体发病机制仍未完全揭示，目前病灶切除术辅以放化疗仍然是大多数恶性肿瘤的常规疗法。因此，围手术期管理对癌症患者预后的影响已成为一个热门的研究课题。值得注意的是，一些临床回顾性数据表明，在手术期间联合应用局麻剂与较低水平的癌症复发和转移率相关[1]。因此，进一步研究局麻药对癌细胞的作用是必要的。

本研究旨在探讨广泛使用的酰胺类局麻药布比卡因对结肠癌细胞的影响，以研究酰胺类局麻药能否在体外培养环境直接抑制癌细胞。

1 资料与方法

1.1 细胞培养

人大肠腺癌细胞系Caco2购自Public Health England（Salisbury，UK）。用于本研究的培养液为RPMI 1640（L-Glu+，Life Technologies，Paisley，UK），其中混合10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum）（Fischer Scientific，Leicestershire，UK）和1%青霉素-链霉素（Sigma-Aldrich，Dorset，UK）。在McCoy's 5A Medium Modified（Sigma-Aldrich）培养箱中（37℃，5%CO2）细胞在加15 mL制备培养液的T75培养瓶中培养，并至少每两天更换一次培养液。从培养瓶底部分离细胞时使用5ml 0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.53mM EDTA /瓶，经5 min消化后离心10 min，细胞板重悬于30 mL培养基中以在培养瓶中种植（接种密度为5×104个活细胞/cm2）。

1.1.1 培养皿中的细胞接种

在60 mm培养皿和96孔板中，细胞通过细胞计数器分别按0.8×106/3 mL和5×104/200 μ的密度在培养液中培养。

1.1.2 药物处理

用制备培养液稀释布比卡因盐酸盐等渗溶液（Marcaine，0.5%w / v，AstraZeneca，Luton，UK）到1 mM，而DPBS（Modified 1×，Thermo Scientific，Utah，USA）与载体以和实验组相同的比例加入培养液中。当细胞生长面积达90%时给予药物处理24 h。

1.2 方法

1.2.1 MTT法

将细胞植于96孔板中培养过夜，各处理组取5个样孔，每孔加入5 mg/mL的噻唑蓝（MTT）（Thermo Scientifc）培养3 h后加入100 μL二甲基亚砜并在室温下避光放置2 h。充分振荡后将孔板置于酶联免疫检测仪上570 nm处各样孔的吸光度（OD值）。各孔内细胞存活率为OD值与空白组OD值的比值。

1.2.2 免疫荧光

通过对Ki67免疫染色测定细胞增殖率。将多鸟氨酸包被的玻璃盖玻片置于培养皿中以利细胞附着。将细胞固定洗后将盖玻片转移至24孔板，并在室温下用3%驴血清（Millipore，UK）封闭1 h。随后将细胞在含有Ki67初级抗体（1：200，鼠多克隆抗体；DakoCytomation，Produktionsvej，Denmark）的PBST中4℃培育过夜。第二天洗涤后避光敷二抗（200μl/孔，1：200，IgG，Florence；Millipore）1 h。洗涤后滴加DAPI放置到载玻片上。在Nikon E1000M（Nikon，Surrey，UK）荧光显微镜下以20×物镜观察细胞。用相同的曝光设置拍摄图像。

1.2.3 Western blot法

使用Western blot法检测caspase3的相对表达量。处理或对照24 h后，细胞由裂解液分解脂质膜。将细胞培养皿置于冰上半小时后离心10 min将蛋白上清液移至新管中，用Bradford（Bio-Rad laboratories，Hercules， CA，USA）蛋白定量测算50 μg蛋白质/组的样本体积。以3：1的比例混合样品和SDS样品缓冲液（Invitrogen）后95℃振动10 min。室温下离心3 min后将样品与5 μg、Sharp上样液一起注入NuPAGE4～12%Bis-Tris预制凝胶（Thermo Scientific，UK）并以200 V电泳50 min。后用蒸馏水漂洗凝胶并转移到PVDF膜上以甲醇固定，以脱脂乳封闭1 h。使用初级抗体caspase3 p17 （H-60）（3：1000；兔多克隆抗体；Santa Cruz Biotechnology，UK）标定膜。第二天洗膜后在室温下孵育二抗1 h。用TBST洗涤后，通过增强化学发光（ECL）系统（Santa Cruz，Dallas，TX，USA）和Syngene GeneSnap软件（Syngene，Cambridge，UK）成像。本实验使用GAPDH作为内参，用ImageJ评估蛋白质条带的灰度强度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行统计分析，计量资料以“s”表示，采用t检验；计数资料采用x2检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

本实验通过有丝分裂标记物Ki-67蛋白质进行免疫染色以检测增殖状态，B组Ki-67阳性比率显著低于N组和V组，差异有统计学意义（P＜0.05）；MTT实验和Western blot实验中，应用1 mM布比卡因24 h并未引起细胞显著凋亡或坏死以及凋亡蛋白caspase3的表达变化，见表1。

表1 三组Caco2细胞增殖阳性率、存活率和凋亡蛋白表达的比较（n=3，s）

表1 三组Caco2细胞增殖阳性率、存活率和凋亡蛋白表达的比较（n=3，s）

注：与N组相比，ap＜0.05

组别 增殖阳性率 细胞存活率 凋亡蛋白表达N组 92.33±6.74 98.22±1.11 1.06±0.35 V组 98.66±1.17 97.56±2.00 1.24±0.52 B组 54.93±7.64a96.25±2.79 1.35±0.43

3 讨 论

根据以上结果，1 mM布比卡因处理24 h在Caco2细胞系中可显著引起细胞周期停滞而不能诱发细胞凋亡。

噻唑蓝可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶水解为蓝紫色结晶甲瓒并被二甲基亚砜溶解，而该反应不会出现在凋亡或坏死的细胞中。因此通过对此化学物质的吸光值检测可间接反应细胞活性。基于癌细胞自身在体外培养条件下的存活状态，对照组/实验组与空白组的比值可以较为准确地反应出药物处理对细胞活性的影响。

Western blot实验此处用于检测大肠癌细胞中凋亡蛋白caspase3在布比卡因处理后的表达水平。Caspase3属于蛋白水解酶家族并以前体形式存在于胞浆中。当细胞遭遇外界损伤引发胞内caspase家族级联反应时，caspase3作为下游执行蛋白，在前体被水解为活性形式后可诱发细胞凋亡。本实验通过检测caspase3裂解后活性形态表达量以探寻布比卡因能否抑制癌细胞的活性。

作为细胞增殖的必要蛋白，核蛋白Ki67广泛存在于间期细胞中。Ki67蛋白质仅存在于处于G1-M细胞周期的细胞中，而不存在于静息或损伤的细胞中，对于静息细胞和受损细胞，细胞核中Ki67消失。增殖是癌症进展和恶性肿瘤的另一个重要因素并与许多复杂的细胞通路相关联，如NF-γB通路和PI3K/Akt/mTOR通路[2]。在本研究中，在1 mM布比卡因处理24 h后，Ki67+细胞的百分比在Caco2细胞中显著降低，这意味着局麻药可诱导细胞周期停滞。此外已有实验证实酰胺类局麻药罗哌卡因和布比卡因具有对结肠腺癌细胞的体外抑制作用[3]。

复合麻醉中局麻药的使用可以减弱机体免疫抑制，特别是对自然杀伤细胞有活性恢复作用[4]。同时，进一步研究指出酰胺类局麻药本身对癌细胞具直接抑制作用[5]。其机制包括通过阻断电压门控Na+通道而抑制MAPK转录途径降低结肠癌细胞的侵袭力[6]。此外，酰胺类局麻药还可以通过TNF-α诱导的Src激活和细胞间粘附分子-1磷酸化来抑制肺癌细胞的转移，这两者都不依赖于钠通道阻滞剂的特性[7]。然而，关于这类抑制作用的特定分子机制仍然需要更多的研究。

本实验结果显示布比卡因可对结肠癌细胞的增殖能力发挥直接抑制作用而不能诱发显著凋亡。由于局麻药的不同应用方法会导致较大的血浆浓度跨度，因而此结论还需要进行更多的时间和浓度相关性在体实验和临床研究去验证。

[1] Biki,B,E.Mascha,D.C.Moriarty,J.M.etal (2008)."Anesthetic technique for radical prostatectomy surgery affects cancer recurrence：a retrospective analysis."Anesthesiology 109(2)：180-187.

[2] Feitelson,M.A.,A.Arzumanyan,R.J.Kulathinal,S.W.Blain,et al (2015)."Sustained proliferation in cancer：Mechanisms and novel therapeutic targets."Semin Cancer Biol 35 Suppl：S25-54.

[3] Bundscherer,A.,M.Malsy,K.Gebhardt,T.et al (2015)."Effects of ropivacaine,bupivacaine and sufentanil in colon and pancreatic cancer cells in vitro."Pharmacol Res 95-96：126-131.

[4] Wada,H.S.Seki,T.Takahashi,N.Kawarabayashi,H.Higuchi,Y. Habu,S Sugahara and T.Kazama (2007)."Combined spinal and general anesthesia attenuates liver metastasis by preserving TH1/ TH2 cytokine balance."Anesthesiology 106(3)：499-506.

[5] Byrne,K.,K.J.Levins and D.J.Buggy (2016)."Can anestheticanalgesic technique during primary cancer surgery affect recurrence or metastasis?"Can J Anaesth.63(2)：184-92

[6] House,C.D,B.D.Wang,K.Ceniccola,et al (2015)."Voltage-gated Na+ Channel Activity Increases Colon Cancer Transcriptional Activity and Invasion Via Persistent MAPK Signaling."Sci Rep 5：11541.

[7] Piegeler,T,E.G.Votta-Velis,G.Liu,et al (2012)."Antimetastatic potential of amide-linked local anesthetics：inhibition of lung adenocarcinoma cell migration and inflammatory Src signaling independent of sodium channel blockade."Anesthesiology 117(3)：548-559.

本文编辑：赵小龙

R735.3+4

B

ISSN.2095-8242.2017.003.547.02

韩冲芳，E-mail：hanchongfang2003@foxmail.com