ABO血型基因变异体引起正反定型不合1例

赵领军

ABO血型基因变异体引起正反定型不合1例

赵领军

目的 采用分子生物学技术分析ABO血型鉴定正反定型不合1例，为保障患者的输血安全提供依据。方法ABO血型血清学鉴定采用微柱凝胶法。提取全血DNA，用序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）进行ABO基因分型；用PCR法扩增ABO基因1～7号外显子进行直接测序，测序结果与A101序列进行比较。结果 患者血型表现为正反定型不符，正向鉴定为O型，反向鉴定仅发现有抗-B凝集素，结果为A型。患者红细胞和抗-AB单克隆抗体有微弱的凝集。ABO PCRSSP基因分型表明患者为杂合O1/A基因型，进一步对外显子扩增测序发现ABO第6外显子存在248A＞G误义突变，导致糖基转移酶83位天冬氨酸被甘氨酸替代（Asp83Gly）。用自行设计的引物采用PCR-SSP法对350例献血者进行248A＞G突变频率调查，未发现阳性。结论 ABO基因248A＞G变异体和缺乏抗-A 凝集素以及A抗原极低水平表达相关。

ABO血型 基因分型 序列特异性引物聚合酶链反应 DNA测序 基因变异体

【Key words】 ABO blood group Genotyping PCR-SSP DNA sequencing Gene variant

ABO血型的正确鉴定对于临床安全输血具有极其重要的意义，错误的血型鉴定可导致受血者发生溶血性输血反应，严重者可能危及生命。研究表明，ABO血型基因型和表型直接相关[1，2]，多数基因变异体表现为一个或多个单核苷酸突变，导致编码的氨基酸改变或提前引入终止密码子。这些基因水平的改变分布在ABO基因的整个编码区，可导致A抗原或B抗原的表达减弱，甚至完全没有表达。血型抗原表达的差异会导致临床血型鉴定正反定型不符，干扰血型鉴定，从而影响临床输血安全。现对1例血型正反向鉴定不符病例进行ABO基因型分析，报告如下。

对象与方法

1 研究对象 患者，58岁，女性，因外周动脉阻塞性疾病来本院治疗。对其血型鉴定时发现正反向定型不符，正向鉴定为O型，反向鉴定为A型。患者无大量输血史和血液干细胞移植记录，对其ABO基因型进行了分析。

2 方法

2.1 标本采集：采集患者静脉血标本，EDTA抗凝，用于血型鉴定和抽提基因组DNA。

2.2 血型血清学实验：应用微柱凝胶法进行ABO血型鉴定，实验方法参照文献[3]。

2.3 试剂和仪器：血型鉴定抗体和人ABO血型反向定型应用上海血液生物医药有限责任公司产红细胞试剂盒。快速抽提血液基因组试剂盒为上海生工生物有限公司产品。引物序列设计参照文献[4]，由华大基因公司合成（表1）。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增试剂为C-TaKaRa （大连宝生物）公司产品。应用Bio-rad C1000 Thermal Cycle PCR扩增仪。ABO PCR-SSP基因分型试剂盒（Inno-Train）购自阿尔沃科技有限公司。

2.4 DNA提取和ABO基因分型：从患者全血中提取基因组DNA及ABO PCR–SSP基因分型，实验操作均按照试剂盒说明书进行。扩增ABO 1～7号外显子、内含子区序列，总反应体系为25 μl，其中Taq High Fidelity DNA 聚合酶（5 U/μl） 0.2 μl，10×reaction buffer 2.5 μl，dNTP mix （10 mmol/μl） 2 μl，上下游引物（10 mmol/μl）各1 μl，DNA模板 1 μl以及ddH2O 17.3 μl。扩增条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 变性30 s，62℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，35个循环； 72 ℃ 5 min。反应产物经2.0% 琼脂糖凝胶电泳分析，溴乙锭染色照相。纯化的PCR反应产物由华大基因公司测序，测序结果与血型基因变异位点数据库（Blood Group Antigen Gene Mutation Database）[5]比对，以A101为标准序列判断其血型基因型。

表1 PCR扩增引物序列

结 果

1 血型血清学实验结果 患者红细胞在常规微柱凝胶法正向血型抗原鉴定中，A抗原和B抗原均为阴性，血型鉴定为O型（图1A）。但反向血型鉴定中，患者血清只与B诊断红细胞凝集呈强阳性（抗-B凝集素），不凝集A1、A2和O诊断红细胞，血型鉴定为A型（图1B）。进一步用单克隆血型抗体对其红细胞进行抗原鉴定，观察到患者红细胞只和抗-AB单克隆抗体有微弱的凝集（图1C）。该患者缺失抗-A凝集素，且有极低水平的A抗原表达，提示有ABO等位基因变异。

2 ABO血型基因分型结果 应用PCR-SSP试剂盒对患者进行ABO基因分型，可观察到患者表现为杂合O1/A基因型[4]（图2）。此外，发现O1和nonO1等位基因特异引物PCR扩增产物量之间有明显差别，nonO1电泳带（泳道1）的亮度显著低于O1（泳道2），提示可能有A等位基因变异体的存在。然而，用PCR-SSP法分析了几种常见的ABO等位基因变异体，结果均为阴性。

图1 微柱凝胶法ABO血型鉴定结果

图2 ABO PCR-SSP基因分型结果

为确定患者的ABO基因序列变异，本研究采用PCR法对ABO基因外显子进行扩增和测序，并将结果和A101标准序列比对。序列分析显示患者ABO基因第6外显子存在杂合261delG（O1等位基因），进一步证实为杂合O1/A（图3）；此外还发现第6外显子存在一个新的248A＞G突变，且该突变有杂合现象（图3）。248A＞G突变在序列上靠近261G，位于特异引物结合靶位区内，因此可影响引物结合DNA模板。上述PCR-SSP分析后观察到nonO1特异引物产物显著低于O1特异引物，说明该突变会影响261G特异引物和模板结合（A/G mismatch），但是不影响261delG特异引物与模板结合。据此，248A＞G突变应和O1等位基因的261delG呈反式构型（in trans），而和nonO1等位基因的261G呈顺式构型（cis）。进一步推测248A＞G突变位于A等位基因上，导致其编码的糖基转移酶83位天冬氨酸被甘氨酸替代（Asp83Gly）。

为研究ABO基因第6外显子248A＞G基因变异体在人群中的频率，随机选择了邢台市350名献血者，自行设计引物（表1）进行ABO PCR-SSP分析，但是未发现一例阳性（图4）。

讨 论

人类ABO血型基因定位于第9号染色体，由7个外显子组成。其中第6号和第7号外显子编码糖基转移酶的主要部分，包括催化区域，因而直接影响A抗原和B抗原的表达[6]。以往研究表明正反向血型鉴定不合往往提示有ABO等位基因变异，常导致发现新的基因变异体[7，8]。在本例患者血型鉴定中我们发现正反向定型不合，正向结果为O型，但在反向鉴定中仅发现抗-B凝集素，结果为A型；进一步分析发现其红细胞和单克隆抗-AB抗体有微弱的凝集，表明有极低水平的A抗原表达。因此，进一步分析ABO基因型。

图3 患者ABO基因第6外显子序列分析

图4 PCR-SSP分析248A＞G突变

分析结果表明，该患者ABO基因呈现出杂合O1/A基因型，且存在杂合的第6外显子248A＞G突变，该突变和261G（non O1等位基因）呈顺式（cis）构型，和261delG（O1等位基因）呈反式（in trans）构型。我们推测248A＞G突变导致糖基转移酶的第6外显子编码的83位天冬氨酸被甘氨酸替代（Asp83Gly）。由于这两个氨基酸性质差别极大，因此这个改变会对糖基转移酶活性产生重要影响。Yu等[9]曾报道在国人B3表型个体中，发现存在247G＞T突变，导致同一位点83位天冬氨酸被酪氨酸替代（Asp83Tyr）。许先国等[10]报道的Bw12表型中存在278C＞T突变，导致93位脯氨酸被亮氨酸替代（Pro93Leu）。根据这些结果，我们推断糖基转移酶的83～93位氨基酸对于酶的正常活性至关重要，这些位置的氨基酸替代可以减弱A抗原或B抗原的表达，或者导致完全不表达。

我们的调查表明新发现的248A＞G突变在人群中的频率极低，然而明确该患者的ABO基因型对于输血和血型诊断有重要意义。尽管没有抗-A抗体，但因为不能完全排除A抗原免疫，对于携带有248A＞G基因变异体的患者，建议输入O型成分红细胞。另一方面，携带有该基因变异体的献血者应该归类于A型血，因为残存的A抗原可能会和受血者抗-A抗体结合，引起免疫反应。综上所述，鉴定ABO血型基因变异体可以促进了解遗传因素对血型的影响，对增进输血安全具有重要意义。

1 Amamoto F，Cid E，Yamamoto，et al. ABO research in the modern era of genomics[J].Transfus Med Rev，2012，26（2）：103–118.

2 Yip SP. Sequence variation at the human ABO locus[J].Ann Hum Genet，2002，66（1）：1-27

3 傅启华，王学峰，向东，等. 临床输血学—理论与实践[M].上海：上海交通大学出版社，2014：219-223.

4 Gassner C，Schmarda A，Nussbaumer W，et al. ABO glycosyltransferase genotyping by polymerase chain reaction using sequence-specific primers[J]. Blood，1996，88（5）：1852-1856.

5 Patnaik SK，Helmberg W，Blumenfeld OO. BGMUT：NCBI dbRBC database of allelic variations of genes encoding antigens of blood group systems[J]. Nucleic Acids Res，2012，40（Database iss）：D1023-1029.

6 Chester MA，Olsson ML. The ABO blood group gene：a locus of considerable genetic diversity[J]. Transfus Med Rev，2001，15（3）：177-200.

7 Olsson M，Irshaid NM，Hosseini-Maaf B，et al. Genomic analysis of clinical samples with serologic ABO blood grouping discrepancies： identification of 15 novel A and B subgroup alleles[J]. Blood，2001，98（5）：1585-1593.

8 Bugert P，Scharberg EA，Janetzko K，et al. A novel variant B allele of the ABO blood group gene associated with lack of B antigen expression[J]. Transu Med Hemother ，2008，35（4）：319-323.

9 Yu LC，Twu YC，Chou ML，et al. Molecular genetic analysis for the B（3） allele[J]. Blood，2002（4）：1490-1492.

10 许先国，洪小珍，刘瑛，等. α1，3半乳糖基转移酶新等位基因278C＞T的鉴定[J].中华医学遗传学杂志，2006，23（6）：631-634.

A Case Report of Forward/Reverse Blood Grouping Discrepancy Resulting from ABO Gene Variant

ZHAO Lingjun.
Department of Clinical Laboratory，The Third Hospital of Xingtai City，Xingtai 054000

Objective To analyze a discrepancy in results of forward/reverse ABO blood grouping with molecular analysis and provide knowledge for safe blood transfusion. Methods Column gel testing was used for serological ABO blood grouping. Genomic DNA was extracted from whole blood and PCR-SSP was used for ABO genotyping. PCR was performed to amplify ABO exons 1 to 7 and the amplification products were sequenced directly. The obtained sequences were compared with wild type A101 to identify sequence variation. Results Blood grouping indicated the discrepant results of forward/reverse ABO typing. Forward typing produced blood group O，while reverse typing produced blood group A as only anti-B isoagglutinins were present. A monoclonal anti-AB antibody detection revealed a weak agglutination with patient's RBCs. ABO genotyping with PCR-SSP indicated a heterozygous O1/A type，and further PCR and ABO exons sequencing identified a new 248A＞G missense mutation in exon 6，which led to the replacement of Aspartate at position 83 with glycine. PCR-SSP using newly designed 248A＞G mutation-specific primer was performed to investigate the frequency of this new mutation among regular blood donors but none turned out to be positive. Conclusions This ABO gene 248A＞G mutation is associated with the absence of anti-A isoagglutinins and weak A antigen expression.

R457.1+1 R392.11

A

1671-2587（2017）02-0178-05

2016-12-22 ）

（本文编辑：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.02.025

054000 河北省邢台市第三医院检验科

赵领军（1964–），女，河北邢台人，副主任检验技师，学士，主要从事临床输血及相关研究，（Tel）0319-2206073（E-mail）hbyml@sina.com。