IGF1/2在金鱼的不同胚胎发育时期与不同组织中的分化表达

王 道，施晓波，陈建林

中南大学湘雅二医院妇产科，中国 长沙 410011)

IGF1/2在金鱼的不同胚胎发育时期与不同组织中的分化表达

王 道，施晓波，陈建林

中南大学湘雅二医院妇产科，中国 长沙 410011)

胰岛素样生长因子(insuline-like growth factors，IGFs)是一类具有胰岛素样代谢和促进有丝分裂功能的多肽，包括IGF1和IGF2，对调节垂体生长激素合成和分泌起着重要的作用，同时还参与了细胞的增殖、生长、分化等过程.利用RT-PCR在mRNA水平上检测了IGF1/2基因在金鱼不同组织和不同胚胎发育时期的表达.结果表明，IGF1基因在肝脏中的表达量最高，在大脑、肌肉及精巢的表达量相对较低；IGF2基因在脾脏中的表达量最高，在肾脏、卵巢及精巢的表达量相对较低.IGF1/2基因在不同发育时期基本上呈现由低到高的趋势.研究表明，IGF1/2基因在金鱼的不同组织和胚胎发育过程中可能具有重要的作用，但其具体机制还有待于进一步研究.

IGF1/2；金鱼；组织器官；胚胎发育

胰岛素样生长因子(insuline-like growth factors，IGFs)在调节鱼类的垂体生长激素合成和分泌中起着非常重要的调节作用[1-2].IGFs是一类具有胰岛素样代谢和促进有丝分裂功能的多肽，依照IGF的性能可以分为IGF1和IGF2.胰岛素样生长因子是由大多数器官和身体组织产生的生长因子，它们对机体代谢和细胞增殖、生长、分化、自分泌、旁分泌等起作用，而且大多数已知的IGF信号都是通过胰岛素样生长因子1型受体(IGF1R)来介导的.胰岛素样生长因子-1主要参与介导生长激素(GH)产生内分泌的效应，IGF1信号转导经由与存在于细胞膜表面的IGF1受体(IGF1R)结合，其胞质酪氨酸激酶结构域连接到RAS-RAF-MAPK和PI3K-PKB/AKT信号或胞外信号调节激酶(ERK)/有丝分裂原活化蛋白激酶(MAP)启动MAPK信号通路，以激活细胞生长和增殖，并抑制程序性细胞死亡[3-4].IGF2是一种广泛表达的多肽激素，主要在肝脏和子宫内通过胎盘分泌，是胚胎生长和发育过程中的重要调节因子.Kadakia[5]等发现IGF2基因的过表达与胎儿的过度生长相关联，并且在脂肪组织的生成中发挥重要作用.随着进一步的研究，IGF2可能成为未来婴幼儿肥胖的标记物[6].

迄今为止，研究人员在高等哺乳动物中对IGFs系统的研究已经成熟，但是对于低等鱼类系统的研究还非常少，主要集中在日本鳗鲡、虹鳟、金头鲷和斑马鱼等少数鱼类[7-10].为了研究IGF1/2基因在低等脊椎动物胚胎及组织中的表达与功能，作者以金鱼为实验材料，初步分析IGF1/2基因在金鱼不同的胚胎发育时期及不同组织的分化表达模式，以期为后续探讨IGF1/2基因的功能提供一定的基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所需的金鱼源自湖南长沙花鸟虫鱼大市场， 静水养殖在玻璃缸中.用小手术剪刀沿泄殖孔剪开腹部，小心取出8种主要的组织器官：大脑、肌肉、心脏、肾脏、脾脏、肝脏、卵巢和精巢，然后用镊子放入标记好的1.5 mL EP管中，用液氮快速封存，置于-80 ℃冰箱备用.金鱼12个时期的胚胎是在高倍体视镜的观察下，通过精卵结合受精来获得的.12个不同胚胎发育时期分别是：两细胞、多细胞、囊胚期、原肠期、神经胚期、视原期、脑泡期、肌肉效应期、心跳期、眼色素期、体色素期和出膜期.每个1.5 mL EP管置入不同时期的胚胎数目50个左右并标记，同样快速用液氮封存，置于-80 ℃冰箱备用.

1.2 主要试剂及仪器

上海生物工程有限公司合成的IGF1/2 基因特异性引物一对；2xTaq PCR Mastermix(KT201)(北京天根生化科技有限公司)；总RNA提取试剂盒(MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)(日本Takara公司)；快速逆转录试剂盒(RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis kit)(美国Fermentas公司)；Biophotometer 核酸蛋白测定仪(美国Beckmancoulter公司)； S1000 Thermal Cycler PCR仪(美国BioRad公司)；E-Gel imager凝胶成像系统(美国Thermo Fisher公司).

1.3 RNA的提取

提取金鱼8种不同组织和12个胚胎时期的Total RNA，采用Takara公司的总RNA提取试剂盒进行实验.琼脂糖凝胶电泳验证RNA是否提取成功.如果在凝胶电泳图上出现28S和18S两条带，且无拖带现象，28S的亮度是18S的二倍，则证明提取RNA成功.

1.4 反转录PCR

在PCR仪上通过Fermentas反转录试剂盒获取8个组织器官和12个胚胎发育时期 cDNA模板，用引物软件设计IGF1特异引物(正向5′-AAGTGTACCATGCGCTGTC-3′；反向5′-GAGTATCTGTATGCCGTTGC-3′)；IGF2特异引物(正向5′-GAAGTCGGAGCGAGATGTT-3′；反向5′-TGTCTTTCGGGAAGGGTCA-3′)以及内参β-actin正反向引物进行PCR 反应(见表1).PCR反应过程是预先加入设计合成的IGF1/2特异性引物，预变性94 ℃ 5 min，而后 10个循环，94 ℃ 30 s，接着65 ℃ 30 s，72 ℃ 延伸60 s，然后加入内参β-actin 正反引物进行25个循环，72 ℃继续延伸10 min.得到的PCR 最终产物在电泳槽内1.5%琼脂糖凝胶跑胶15 min，在凝胶成像系统紫外光照射下检测并拍照.

表1 PCR所用引物

2 结果

2.1IGF1基因在金鱼不同组织器官和不同发育时期的mRNA结果

经检测IGF1基因在金鱼8个组织中都存在表达.在肝脏中的表达量最高，心脏、脾脏、肾脏次之，在大脑、肌肉及精巢的表达量相对较低(图1).

IGF1基因在金鱼12个胚胎发育时期都存在表达.在体色素和出膜期中的表达量最高，神经胚、视原基、脑泡期、肌肉效应期、心跳期、眼色素期次之，在两细胞期、多细胞期、囊胚期、原肠胚期的表达量相对较低.从两细胞期到肌肉效应期呈现“由低到高”趋势，在心跳期、眼色素期稍有下降，在体色素和出膜期又逐渐升高直至维持高水平(图2).

1.大脑；2.心脏；3.肌肉；4.脾脏；5.肾脏；6.肝脏；7.精巢；8.卵巢图1 IGF1基因在金鱼8种不同组织中mRNA水平的表达Fig.1 The mRNA expression of IGF1 gene in goldfish different tissues

1.两细胞期；2.多细胞期；3.囊胚期；4.原肠胚期；5.神经胚；6.视原基；7.脑泡期；8.肌肉效应期；9.心跳期；10.眼色素期；11.体色素期；12.出膜期图2 IGF1基因在金鱼12个不同发育时期胚胎mRNA水平的表达Fig.2 The mRNA expression of IGF1 gene in goldfish different embryo

2.2IGF2基因在金鱼不同组织器官和不同发育时期的mRNA结果

经检测IGF2基因在金鱼8个组织中都存在表达.在脾脏中的表达量最高，心脏、肌肉、肝脏次之，在肾脏、卵巢及精巢的表达量相对较低(图3).IGF2基因在金鱼12个胚胎发育时期都存在表达.在体色素和出膜期中的表达量最高，神经胚、视原基、脑泡期、肌肉效应期、心跳期、眼色素期次之，在两细胞期、多细胞期、囊胚期、原肠胚期的表达量相对较低.从两细胞期、多细胞一直到体色素和出膜期呈现典型“由低到高”的逐渐升高趋势(图4).

1.大脑；2.心脏；3.肌肉；4.脾脏；5.肾脏；6.肝脏；7.精巢；8.卵巢图3 IGF2基因在金鱼8种不同组织中mRNA水平的表达Fig.3 The mRNA expression of IGF2 gene in goldfish different tissues

1.两细胞期；2.多细胞期；3.囊胚期；4.原肠胚期；5.神经胚；6.视原基；7.脑泡期；8.肌肉效应期；9.心跳期；10.眼色素期；11.体色素期；12.出膜期图4 IGF2基因在金鱼12个不同发育时期胚胎mRNA水平的表达Fig.4 The mRNA expression of IGF2 gene in goldfish different embryo

3 讨论

有丝分裂肽家族的胰岛素样生长因子(IGFs)在生物体内具有不同的功能，主要体现在参与调节细胞增殖、分化有丝分裂原和细胞凋亡等过程[11-12].胰岛素样生长因子系统包括：单链多肽的IGF1和IGF2以及6个结合蛋白(IGFBP1～IGFBP6).IGF1和IGF2分别含有70和67个氨基酸，并且明显类似胰岛素原.胰岛素样生长因子介导多个个体发育阶段如胚胎期、婴儿期、青春期、成年期，并存在于几乎每一个级别的生命系统中，如细胞、组织、器官、生物体及基本生物过程.本研究发现在金鱼中IGF1/2基因在不同组织及胚胎发育阶段广泛表达，这一结果也与上述结论一致.

许多研究人员已证实胰岛素样生长因子家族与几种代谢疾病相关联，其中包括1型糖尿病，近年来甚至还有报道其与癌症有关，特别是乳腺癌、肺癌、结肠癌和前列腺癌，如Werner[13]等人通过流行病和临床试验表明，胰岛素样生长因子(IGFs)是一个使表型正常细胞转变为肿瘤细胞事件发生的生化链的重要介质.Bruchim的临床研究数据也通过回顾一些具体的恶性肿瘤事件证实了IGFs系统的表达和作用的失调与不同的病症有关，从而导致了癌症的发展[14].Han[15]等研究调查了在糖尿病患者中胰岛素样生长因子相关蛋白和大肠癌的发生几率之间的关系，结果提示结直肠癌的糖尿病患者的发生可能与升高的IGFs相关蛋白表达水平相关联.Solarek[16]等发现IGF1和IGF2发挥调节肿瘤细胞增殖和分化的作用，试图了解胰岛素样生长因子的过度活化在癌症发生过程中的主要机制，以此开辟新的抗癌疗法来预防和治疗常见的人类恶性肿瘤.

Zhou[17]等研究斑马鱼发现，在卵泡发育的不同阶段，胰岛素样因子扮演不同的角色，在不同的生理水平上调节IGF信号传导的程度.Silva[18]等研究显示IGF1对原始卵泡发育没有作用效果，但IGF1和IGF2协同能够刺激次级卵泡的生长，在窦状卵泡中，这些胰岛素样生长因子刺激颗粒细胞增殖.IGF1/2基因在金鱼胚胎发育早期的两细胞、多细胞期到体色素和出膜期基本呈现由低到高的逐渐升高趋势，该结果也表明其与鱼类的生长发育成熟密切相关.

在哺乳动物和鱼类中，内分泌的IGF1主要产生于肝脏，能够刺激免疫细胞的生长和分化，并抑制细胞凋亡，是一种有效的生长因子.Franz[19]等研究硬骨鱼证实这种刺激作用经常与升高的内分泌(肝脏来源)的IGF1相关.但是鱼类中IGF2的作用仍然不清楚.本研究中IGF1基因在金鱼的肝脏组织中表现出高度表达的特征，同时IGF2也在肝脏中有较高表达.

特别让科学家感兴趣的是IGF1和IGF2在免疫中所发挥的重要作用.Ge[20]等为了研究IGF在肠道炎症过程中的免疫机制，对肠道上皮细胞产生的IGF1通过实时定量RT-PCR和Western印迹进行评估，结果显示IGF1能够在肠道中抑制免疫炎症反应.Geng[21]则发现IGF1受体(IGF1R)和IGF2受体(IGF2R)在特异性B细胞表达，通过酶联免疫试验证实其增强了白细胞介素(IL)-10的释放.一些研究还指出，自分泌/旁分泌的IGF1与成人免疫器官发育相关联.脾脏是体内最大的淋巴免疫器官，在本研究中IGF1/2基因在金鱼的脾脏中也存在高表达，但是关于IGF1在鱼类组织中免疫细胞的不同定位的研究尚不够多.IGF1仅被定位在不同哺乳动物的免疫细胞类型，在T淋巴细胞特别是巨噬细胞和粒细胞中.在其它鱼类研究中，IGF1在虹鳟鱼头肾分离的吞噬细胞和鲶鱼细胞系的T细胞中被检测到.总之，IGF1/2基因在鱼类发育不同阶段和不同的组织中广泛表达，增加了区分研究它们的生物学功能的难度.后续基础研究可以利用RNAi沉默或者突变基因的方法，揭示在鱼类早期胚胎发育过程中IGF1/2的主要生理学作用和机制.

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(编辑 WJ)

The Temporal and Tissue Expression Patterns ofIGF1/2 Gene in Goldfish(CarassiusAuratus)

WANGDao,SHIXiao-bo,CHENJian-lin*

(Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410011, China)

Insulin-like growth factors (IGFs), including IGF1 and IGF2, are a class of polypeptides with insulin-like metabolic and mitogenic functions. It not only plays an important role in regulating pituitary hormone synthesis and secretion, but also involved in cell proliferation and growth and differentiation processes. In this work, RT-PCR was used to examine the expression ofIGF1/2 gene in different tissues and periods of embryonic development at the mRNA level in goldfish. Our results reveal that theIGF1 gene was expressed the highest level in the liver and to a much less degree in the brain, muscle and testis of goldfish, whereasIGF2 was expressed the highest in the spleen but relatively low in the kidney, ovary and testis. TheIGF1/2 genes were expressed differently at different developmental stages, with the pattern of “low to high” trend. These studies suggest thatIGF1/2 genes should play important roles in embryonic development and in different tissues of goldfish. The exact mechanism remains to be further investigated.

IGF1/2; goldfish; tissue organ; embryonic development

10.7612/j.issn.1000-2537.2017.02.007

2016-11-23

湖南省科技厅基金资助项目(2015JJ4071)

Q786

A

1000-2537(2017)02-0044-05

*通讯作者,E-mail：jianlinchen2009@126.com