卡介菌多糖核酸对CIK细胞活性的影响

黄招琴，苏壬香，钟贝芬，韩慧敏，谷陟欣，颜冬兰，辛 秀，袁 莉，胡 翔,

(1.湖南师范大学生命科学学院，蛋白质化学与基因调控教育部重点实验室，中国 长沙 410081;2.九芝堂股份有限公司博士后工作站，中国 长沙 410205)

卡介菌多糖核酸对CIK细胞活性的影响

黄招琴1，苏壬香1，钟贝芬1，韩慧敏2，谷陟欣2，颜冬兰2，辛 秀2，袁 莉2，胡 翔1,2

(1.湖南师范大学生命科学学院，蛋白质化学与基因调控教育部重点实验室，中国 长沙 410081;2.九芝堂股份有限公司博士后工作站，中国 长沙 410205)

在CIK细胞的培养过程中加入卡介菌多糖核酸，研究其对CIK细胞体外增殖及杀瘤活性等方面的影响.CCK-8检测结果发现低浓度卡介菌多糖核酸处理的CIK细胞相比对照组(生理盐水)，细胞增殖能力和杀瘤效果都显著上调.RT-qPCR结果显示卡介菌多糖核酸处理后的CIK细胞毒活性相关因子(Granzyme B, IFN-γ, TNF-α和TNF-β)mRNA的表达相比对照组都有提高.这些结果可为培养具有更高效杀瘤活性又能大量扩增的CIK细胞提供新思路.

卡介菌多糖核酸；CIK；细胞增值；杀瘤活性

恶性肿瘤严重危害人类健康，目前常规的手术和放化疗治疗方法均不能彻底清除体内的瘤细胞，过继免疫治疗法因具有符合生理、低毒和高效等优点成为重要的肿瘤辅助治疗手段[1].其中，细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells, CIK细胞)是近年来发现的一种非常有前景的过继免疫细胞，具有增殖迅速、杀瘤活性广谱且高效、毒副作用微小等优点，已经成为肿瘤免疫治疗领域的一种新选择[2-4].CIK是以CD3+CD56+T细胞为主的异质细胞群，兼有 NK 细胞和 T 细胞的特征.在功能上，CIK 一方面拥有 T 淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，另一方面还拥有 NK 细胞非 MHC 限制性的杀伤肿瘤的特点，其增殖迅速、对正常造血影响轻微[5].CIK细胞的增殖和细胞毒活性依赖于多种外源性细胞因子的刺激，但何种因子组合为最佳尚无定论，因此研究如何进一步提高CIK的增殖和杀瘤活性已经成为抗肿瘤的过继免疫细胞生物治疗的一个热点[6].卡介菌多糖核酸(BCG polysaecharide and nucleis acid，BCG-PSN)是在卡介苗的基础上，通过热酚法提取卡介菌中的多糖、核酸，混合而制成的免疫活性物质，是我国首创的具有自主知识产权的新型免疫调节剂[7-8].BCG-PSN 能诱导多种免疫细胞的活化，调节多种细胞因子的分泌，可作为一种较好的肿瘤辅助治疗手段[9].由于卡介菌多糖核酸能提高机体免疫力并且辅助提高肿瘤治疗效果，同时CIK细胞亦是肿瘤过继免疫治疗的有效方法，且国内外还没有BCG-PSN联合CIK进行研究的相关报道，因此本课题将两者结合起来研究.为研究卡介菌多糖核酸的生物活性及药理作用，在CIK细胞的培养过程中加入卡介菌多糖核酸，研究其对CIK细胞的体外增殖及对肝癌细胞的毒活性(杀瘤活性)方面的影响，并且探讨其对CIK细胞毒活性相关因子表达的影响.

1. 材料与方法

1.1 材料

淋巴细胞分离自健康志愿者外周血.SMMC-7721肝癌细胞系于上海中科院购买，本实验室长期保存.斯奇康卡介菌多糖核酸注射液(1 mL/支)购自湖南九芝堂制药公司.人血液淋巴细胞分离液购自佳和生物.采血针、采血管、生理盐水购自长沙市第四人民医院.人源CD3单抗购自北京同立源生物科技有限公司，人白介素(IL-2)买自江苏金丝利药业有限公司.DMEM培养液、RPMI-1640和GT-T551培养液，以及胎牛血清均为美国Gibco公司产品.青霉素-链霉素溶液产自碧云天.

1.2 方法

1.2.1 CIK细胞分离及原代培养 采集健康志愿者血液20 mL，平衡温度至室温.取50 mL离心管若干，将血样转移至离心管，用生理盐水稀释至30 mL，充分吹打均匀.将稀释后的血样缓缓加入另一管装有15 mL 淋巴细胞分离液的上方，形成上下两相.22 ℃，390 g离心30 min(加速1，刹车0).离心后血浆层与分离液之间有白膜层可见，分别收集上层血浆和中间白膜层至新的离心管.于收集白膜层的离心管中加入RPMI-1640至45 mL，混匀，22 ℃，1 000 g离心10 min(加速9，刹车9).重复上一步骤两次，离心速度分别改为400 g和201 g，最后一次离心之前取20 μL混匀的细胞悬液进行台盼蓝染色计数，参照《细胞计数SOP》.离心后重悬细胞，按细胞数5×106个/mL加含有500 μg/L CD3 mAB, 1 000 U/mL IL-2和10%FBS的GT-T551培养基诱导培养成CIK细胞.

1.2.2 肿瘤细胞培养 在37 ℃，5%CO2及90%相对湿度的细胞培养箱中用DMEM完全培养液(含10%胎牛血清和100 mg/L青-链霉素溶液)培养SMMC-7721细胞.

1.2.3 CCK-8 检测细胞增殖活力 将培养7 d的CIK细胞数调整至2×106个/mL，于96 孔平底细胞培养板每孔加入细胞悬液50 μL，设实验组和对照组，对照组为生理盐水组，实验组分为5组，分别加入卡介菌多糖核酸终浓度为1，10，50，100，200 mL/L的培养基各50 μL，每个浓度4个平行对照孔，置于细胞培养箱中处理细胞72 h，加入10 μL CCK-8溶液，4 h 后用酶联免疫检测仪检测OD450值A(吸光度的大小与活细胞的数量呈正比).并对数据进行统计学分析.以BCG-PSN 浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，作细胞增殖曲线.

1.2.4 肿瘤杀伤实验 将培养9 d的CIK细胞均分为两组，分别为对照组和实验组，对照组为生理盐水组，实验组为培养基终浓度为10 mL/L的卡介菌多糖核酸，置于细胞培养箱中处理细胞72 h(至12 d).另外，在CIK细胞培养11 d时，将培养至对数生长期的SMMC-7721细胞调整细胞密度为1×105个/mL，于96孔板中铺板每孔100 μL细胞悬液，培养箱中培养24 h.CIK培养至第12天进行CIK杀伤肿瘤细胞实验，弃去SMMC-7721旧的培养液，分别按n(效应细胞)/n(靶细胞)为5∶1,10∶1和20∶1调整两组CIK细胞至相应数目加入SMMC-7721细胞孔中，每个比例3个复孔，同时设单独靶细胞和单独效应细胞对照组，于细胞培养箱中培养4 h. 4 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，细胞培养箱中孵育4 h，酶标仪测定OD450值A.计算杀伤率：杀伤率(%)=[1-(实验组A值-单独效应细胞组A值)/单独靶细胞组A值]×100%.

1.2.5 细胞总RNA的提取及cDNA的合成

(1)卡介菌多糖核酸处理CIK细胞:调整培养至第9天的CIK细胞数目至2×106个/mL，于6 孔平底细胞培养板每孔加入细胞悬液1 mL，设实验组和对照组，实验组加入卡介菌多糖核酸终浓度为10 mL/L的培养基1 mL，对照组加入生理盐水，置于细胞培养箱中培养72 h.

(2)RNA提取及反转录:按TRIZOL法提取CIK细胞总RNA，按照Takara反转录试剂盒说明书操作，将RNA反转录成cDNA.

1.2.6 实时定量PCR

(1)引物的设计与合成:根据GenBank中基因的序列，查找文献并用Primer Primer 5 软件设计CIK相关毒活性因子Granzyme B，TNF-α，TNF-β，IFN-γ，Actin(内参)基因引物(见表1).将设计好的目的引物序列发给上海生工公司合成.

表1 PCR所用引物

(2)引物验证：引物合成后，加入灭菌水溶解至10 μmol/L.先做一个普通PCR检测引物是否能克隆出目的片段，PCR反应体系如表2，按照体积从大到小加溶液至总体积为20 μL.

表2 PCR反应体系

PCR体系加完后用枪轻轻混匀，放入PCR仪扩增片段.扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，重复29个循环，最后72 ℃延伸5 min.用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR反应完成后产物.

(3)荧光定量PCR:反应体系见表3，共30 μL,具体操作按照Takara SYBR RT-qPCR产品说明书进行.

表3 荧光定量PCR体系

1.2.7 统计分析 数据以均数±标准差表示，采用SPSS 19.0统计软件及Graphpad软件进行方差及显著性分析，检验水准(P)设为0.05.

2 结果与分析

2.1 CIK细胞形态观察

CIK细胞即细胞因子诱导的杀伤细胞，它是从人血液分离出来的单核淋巴细胞经IL-2和CD3单抗等细胞因子诱导培养产生的以CD3+CD56+T细胞为主的异质细胞群.CIK是一种悬浮细胞，相比癌细胞其体积较小.经过适应期的CIK细胞随着培养时间延长，细胞数量对数生长且会形成细胞球，细胞体积在7～12 d时有所增大，之后几乎不变.图1是显微镜下不同时期的CIK细胞形态，A～D分别对应从人血中分离后培养至1，4，7，11 d的CIK细胞.

图1 不同时期的CIK细胞图片Fig.1 Images of CIK cells in different growth period

2.2 卡介菌多糖核酸对CIK细胞增殖的影响

在CIK细胞培养至第7天时，加入不同浓度的卡介菌多糖核酸处理细胞72 h，然后用CCK-8试剂盒检测CIK细胞活性.分析数据结果，以不同BCG-PSN浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作量效曲线图，结果如图2所示.由图可知，随着BCG-PSN浓度的增加，吸光度呈现先升后降的趋势，在BCG-PSN浓度增加到10 mL/L时，CIK活细胞数目最多,吸光度最大且明显高于未加药组，统计分析差异有意义(*p<0.05).浓度继续增加吸光度反而下降，但仍然比未加药组高，到200 mL/L时，CIK细胞数量接近未加药组.结果说明卡介菌多糖核酸对CIK细胞增殖的影响与剂量依赖有关，低浓度下可促进增殖，高浓度反而无明显效果.

2.3 卡介菌多糖核酸对CIK细胞杀伤活性的影响

为了验证卡介菌多糖核酸对CIK细胞杀瘤活性有影响，笔者将培养至第9天的CIK细胞加入卡介菌多糖核酸处理72 h(至12 d)，再进行CIK杀伤SMMC-7721肿瘤细胞实验.杀伤率统计结果如图3.结果显示，无论是实验组还是对照组，随着效靶比增大CIK细胞杀伤肿瘤效果增强；相比对照组，实验组CIK细胞在效靶比为5∶1和10∶1时杀伤率有显著提高(*p<0.05)，在靶效比为20∶1时杀伤率也比对照组稍高.结果说明，卡介菌多糖核酸对CIK细胞杀伤肿瘤细胞的活性有显著增强作用.

图2 BCG-PSN影响CIK细胞增殖的量效曲线Fig.2 The dose-effect curve of BCG-PSN on CIK cells

图3 CIK 对SMMC-7721细胞的杀伤效率统计图Fig.3 Cytotoxicities of CIK cells against SMMC-7721 cells

2.4 BCG-PSN对CIK细胞毒活性相关因子RNA表达的影响

收集生理盐水和10 mL/L的卡介菌多糖核酸处理72 h的两组CIK细胞，提取RNA反转录成cDNA，做荧光定量PCR检测CIK细胞毒活性相关因子的表达.琼脂糖凝胶电泳检测CIK细胞RNA质量，可看到28S和18S两条清晰的带，如图4.RT-qPCR结果显示BCG-PSN实验组CIK细胞Granzyme B(颗粒酶B)，TNF-α，TNF-β的mRNA表达量较对照组明显升高(*p<0.05), IFN-γ的mRNA表达量较对照组也有所升高，如图5.表明卡介菌多糖核酸的确能促进CIK细胞Granzyme B，TNF-α，TNF-β和IFN-γ等mRNA的表达，这可能是BCG-PSN增加CIK杀瘤活性的原因之一.

Mark：DNA standard marker；1：对照组CIK细胞RNA；2：BCG-PSN实验组CIK细胞RNA.图4 CIK细胞RNA鉴定Fig.4 Identification of RNA from CIK cells

图5 RT-qPCR检测CIK细胞毒活性相关因子表达Fig.5 Expression levels of granzyme B, TNF-α, TNF-β, IFN-γ measured by RT-qPCR

3 讨论

卡介菌多糖核酸是从卡介菌中提取的核酸、多糖等活性物质混合而成的免疫增强剂，具有调节机体免疫水平、增强机体抗感染和抗过敏的能力[10]，还可促进T 淋巴细胞的增殖与活化及辅助提高机体内NK杀伤活力[11].於敏等[12]研究表明卡介菌多糖核酸能显著提高断奶仔猪外周血淋巴细胞分化增殖，推测其可通过直接作用于外周血淋巴细胞从而增强个体免疫力.本研究结果表明低浓度卡介菌多糖核酸可显著促进体外培养的CIK细胞增殖分化，而在机体免疫应答过程中，T淋巴细胞和B淋巴细胞的激活、分化、增殖起着重要的作用，因此，卡介菌多糖核酸或可通过直接作用于人周血淋巴细胞从而增强机体免疫力.

卡介菌多糖核酸影响CIK细胞的体外增殖及CIK杀伤肝癌细胞的特点尚无报道.SMMC-7721肝癌细胞为本实验室常用细胞系，材料易得且细胞个体大、生长较快易于实验，因此在此文中笔者选择其作为CIK的靶细胞进行杀伤实验.研究发现经BCG-PSN处理后的CIK细胞相比对照组杀瘤效果有明显增加，在效靶比为5∶1和10∶1时杀伤率有显著提高，在靶效比为20∶1时杀伤率也比对照组稍高，表明卡介菌多糖核酸能提高CIK的杀伤能力.

CIK杀伤肿瘤细胞的具体机制还并不清楚，根据之前相关的文献报道，笔者猜测可能与相关毒活性因子的表达相关，于是做荧光定量PCR检测了实验组和对照组处理后的CIK细胞Granzyme B,TNF-α,TNF-β和IFN-γ的表达，结果发现这几类因子的RNA表达水平的确有所提高.Granzyme B,TNF-α,TNF-β和IFN-γ这几种因子在CIK细胞杀瘤过程中发挥着重要作用，本研究也证实了其RNA表达升高促进了CIK杀瘤效果.为了进一步验证它们在蛋白水平的表达，后续将购买TNF-α和IFN-γ的ELISA试剂盒以检测其在CIK细胞的胞外分泌情况.

颗粒酶B(Granzyme B)是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤(NK)细胞颗粒中丝氨酸蛋白酶家族中发挥杀伤作用的主要效应分子，它能进入靶细胞，激活caspase级联反应，迅速引起靶细胞DNA的断裂，使细胞快速凋亡[13].因此，它是杀伤细胞的标志性分子之一.

肿瘤坏死因子 (Tumor Necrosis Factor, TNF )是一类重要的细胞因子，包括TNF-α和TNF-β两类，TNF-α由巨噬细胞和淋巴细胞分泌产生，而TNF-β则由活化的T细胞分泌[14].TNF具有广泛的生物学活性，对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用，还能刺激T细胞、B细胞、单核巨噬细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞使其功能增强.本研究结果显示，相比生理盐水对照组，卡介菌多糖核酸能显著提高TNF-α及TNF-β的mRNA表达量.

γ-干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)是I型辅助T细胞(Th1细胞)的标志性细胞因子，能抑制肿瘤细胞分裂，增强巨噬细胞及 NK 细胞的杀伤性.另外γ-干扰素还可增加巨噬细胞对抗原的吞噬，调动机体免疫系统，提高NK细胞对靶细胞的杀伤以及T淋巴细胞和B淋巴细胞的激活，增强机体抗肿瘤免疫应答能力[15].

CIK是目前应用最广泛的肿瘤过继免疫治疗细胞，因其治疗效果与细胞输注剂量、效应细胞比例和对肿瘤细胞毒性有着密切关系，因此提高其体外的增殖效率和毒性是首要解决的问题.本研究证实低浓度下的卡介菌多糖核酸能促进CIK细胞增殖，又能提高CIK的杀瘤效果，说明卡介菌多糖核酸可以作为一种较好的肿瘤辅助治疗药物.另外CIK细胞杀瘤效率提高的同时相关毒活性因子的表达也增加，揭示其可能是杀伤肿瘤细胞的途径之一，这也为进一步研究CIK杀伤肿瘤细胞机制奠定基础，为抗肿瘤过继免疫治疗提供一些新思路.

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(编辑 WJ)

The Impact of BCG-PSN on the Activity of CIK Cells

HUANG Zhao-qin1, SU Ren-xiang1, ZHONG Bei-fen1, HAN Hui-min2, GU Zhi-xin2, YAN Dong-lan2, XIN Xiu2, YUAN Li2, HU Xiang1,2*

(1.Key Laboratory of Protein Chemistry and Developmental Biology of State Education Ministry of China, College of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410081, China;2.Jiuzhitang Limited Share Company Postdoctoral Workstation, Changsha 410205, China)

The BCG polysaccharide and nucleic acid (BCG-PSN) was added to CIK cells to study CIK cells’ responses on the proliferation and tumoricidal activity in vitro. CCK-8 results showed that the CIK cells treated with low dose BCG-PSN, compared with control group (normal saline), were significantly enhanced on the proliferation and tumoricidal activity. RT-qPCR results revealed that the expression of CIK Granzyme B, IFN-γ, TNF-α, TNF-βmRNA of BCG-PSN group was higher than that of the control group. These results lay the foundation for how to cultivate a large number of CIK cells with high tumoricidal activity, and provide new ideas for the therapy of anti-tumor adoptive immunity.

BCG-PSN; CIK cell; cell proliferation;tumoricidal activity

10.7612/j.issn.1000-2537.2017.02.005

2016-03-22

湖南省博士后基金资助项目(2012RS4016);长沙市科技局重点资助项目(K1303113-31)

Q78

A

1000-2537(2017)02-0033-06

*通讯作者,E-mail：huxiang@hunnu.edu.cn