蒰柑原生质体培养过程中羟自由基和总活性氧水平的分析

徐小勇++许晓玲++刘玉玲

摘要：以椪柑愈伤组织和试管苗为材料，通过酶解分离原生质体，于液体培养和观察；采用羟自由基测定试剂盒和电子顺磁共振技术分析羟自由基变化，通过流式细胞仪检测总活性氧水平变化。结果发现，培养的前3 d，愈伤组织原生质体羟自由基和总活性氧水平下降，而叶肉原生质体则升高；培养的后3 d，除愈伤组织原生质体羟自由基水平升高外，其他都下降。椪柑叶肉原生质体可能由于氧化胁迫引起死亡，而愈伤组织原生质体能较好地控制总活性氧水平从而顺利进入再生，另外培养6 d时其羟自由基含量的升高可能与细胞壁再生等有关。

关键词：椪柑；原生质体；羟自由基；活性氧

中图分类号： S666.104+.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0196-03

原生质体指采用机械法或酶解法去除细胞壁的裸露细胞，是研究植物生命理论基础问题的理想体系，还可对其进行各种细胞及遗传操作。因此，原生质体技术已广泛地用于植物体细胞杂交、遗传转化、种质资源保存、基因瞬时表达等方面。在柑橘植物上，原生质体培养及体细胞杂交技术为其遗传育种工作开辟了一条新思路，它已成为柑橘砧木及接穗品种改良的重要手段[1-2]。目前，柑橘原生质体主要从愈伤组织和叶片分离得来，但只有愈伤组织分离的原生质体可再生成植株，而叶肉原生质体目前尚不可分裂再生，还不能用于柑橘遗传改良[3-4]。迄今，这2种类型原生质体再生能力差异的机制尚不清楚。

虽然原生质体再生能力差异普遍存在于植物、基因型、外植体之间，但是这种现象的相关研究进展缓慢。直至20世纪90年代，有学者发现活性氧在原生质体分离中大量产生[5-7]，然而在原生质体培养阶段，不同再生能力的原生质体活性氧含量虽然都表现出下降的趋势，但是不可再生型原生质体活性氧水平相对较高[8-9]。上述研究表明，氧化胁迫可能是造成不可再生型原生质体再生难的原因。为此，笔者所在课题组以氧化胁迫为切入点开展了柑橘原生质体再生能力差异的研究[10-11]，重点对总活性氧水平及活性氧另一种重要成分（羟自由基）进行检测，以期了解活性氧在柑橘原生质体再生中的作用。

1材料与方法

1.1植物材料

椪柑（Citrus reticulata）胚性愈伤组织用悬浮培养基（MT+0.5 mg/L ME+1.5 mg/L谷胺酰氨+50 g/L蔗糖）悬浮培养4代后用于原生质体分离；取新鲜椪柑果实，挑选出大粒种子，经消毒后接种于MT培养基上，大约培养30～40 d，叶片充分展开后用于原生质体分离。

1.2椪柑原生质体分离与培养

原生质体的分离与纯化参照Xu等的方法[10]，稍作修改。

愈伤组织原生质体的分离：取3 g愈伤组织于培养皿中，分别加入2 mL的0.7 mol/L EME培养基（MT+0.7 mol/L蔗糖+0.5 g/L ME）和酶液（2%纤维素酶R-10+2%离析酶R-10+12.8%甘露醇+0.011% NaH2PO4+0.12% MES+0.36% CaCl2·2H2O）。封口膜封口，28 ℃暗条件下酶解 18～20 h。

叶肉原生质体的分离：用手术刀片将试管苗叶片切成 1～2 mm 宽的条状，之后放入预先加入2 mL 0.6 mol/L EME（MT+0.6 mol/L蔗糖+0.5 g/LME）培养基中，最后加入 2 mL 酶液（2% 纤维素酶R-10+2%离析酶R-10+10.9%甘露醇+0.011% NaH2PO4+0.12% MES+0.36% CaCl2·2H2O）。封口膜封口，28 ℃暗条件下酶解20～24 h。

酶解完成后的原生质体（酶解混合物）通过孔径为 45 μm 的不锈钢筛网过滤，并用CPW13洗涤、离心。然后采用CPW13/CPW26界面梯度离心，用吸管将2个液面间的原生质体带吸出。最后将原生质体悬浮于液体培养基MA（MT+0.15 mol/L蔗糖+0.45 mol/L甘露醇+40 mg/L腺嘌呤）中，封口转入28 ℃恒温培养箱培养。

1.3椪柑原生质体培养过程中羟自由基含量变化的测定

分别采用羟自由基测定试剂盒和电子顺磁共振（EPR）仪方法测定。

羟自由基测定试剂盒测定方法：参照南京建成生物科技有限公司的羟自由基测定试剂盒说明书进行。试验重复3次，数据采用软件SPSS 17.0进行分析。

电子顺磁共振仪测定方法：首先收集原生质体悬液，离心弃上清，用CPW13清洗2次，再用CPW13重悬原生质体，最后将90 μL原生质体悬液与30 μL浓度为200 mmol/L的二甲基吡啶N-氧化物（DMPO）溶液充分混匀后，采用电子顺磁共振仪（Brucker ESP300）记录捕获羟自由基的电子顺磁共振信号。

1.4椪柑原生质体培养过程中活性氧含量的测定

采用碧云天生物技术有限公司的活性氧检测试剂盒进行测定。具体步骤如下：首先将原生质体悬浮于10 μmol/L的二氯荧光素双醋酸盐（DCFH-DA）溶液中，37 ℃水浴锅内孵育20 min，每隔3～5 min颠倒混匀一下，使探针和原生质体充分接触。之后，用原生质体培养液MA将处理完的原生质体洗涤3次，以充分除去未进入原生质体内的DCFH-DA。最后设置1个对照管，按照1 ∶1 000的体积比加入阳性对照Rosup，并设置1个未加DCFH-DA的阴性对照。做好前处理后，30 min内上样，用FACSAria流式细胞仪进行检测。试验重复3次，数据采用SPSS 17.0进行分析。

2结果与分析

2.1椪柑原生质体培养与取材

为便于采集原生质体用于试验分析，本研究采用液体培养方法，并进行持续观察。刚分离的椪柑愈伤组织原生质体与叶肉原生质体细胞膜完整（图1-A、图1-D），活力较高，而在培养6 d的过程中表现出明显差异。绝大多数愈伤组织原生质体的细胞膜保持完整，且在培养6 d时多数原生质体变椭圆（图1-E、图1-F），表明已完成了细胞壁再生。叶肉原生质体在培养3 d时就大量破裂死亡，培养6 d几乎全部破裂（图1-B、图1-C）。因此，本研究以刚分离（0 d）、培养3、6 d的原生质体为试验材料，进行羟自由基和总活性氧水平的检测。

2.2椪柑原生质体羟自由基含量的测定

本研究中，采用间接法（羟自由基测定试剂盒）和直接法（电子顺磁共振测定法）分析了椪柑原生质体羟自由基含量的变化。

2.2.1羟自由基测定试剂盒检测椪柑原生质体培养过程中产羟自由基能力变化从刚分离到培养6 d，愈伤组织原生质体产羟自由基能力先下降后上升；而叶肉原生质体则相反，即先上升后下降（图2）。 刚分离时的愈伤组织原生质体产羟自由基能力是叶肉原生质体的2.6倍，这种差异可能与原生质体来源不同有关。培养3 d时，愈伤组织原生质体体内抗氧化系统被激活[10]，产羟自由基能力受到抑制；而在培养6 d时，产羟自由基能力却意外升高。对于叶肉原生质体，在培养3 d时出现大量破裂死亡现象（图1-B），这与其产羟自由基能力的上升相符合，至培养6 d时，叶肉原生质体几乎全部破裂，产羟自由基能力也明显下降。

2.2.2电子顺磁共振波谱仪检测椪柑原生质体培养过程中羟自由基变化本研究利用自旋捕捉剂DMPO捕捉羟自由基后，经电子顺磁共振仪检测，得到羟自由基的特征谱图，根据相对峰高可判断信号的强弱，即羟自由基含量的高低。通过比较愈伤组织原生质体和叶肉原生质体的电子顺磁共振谱图（图3、图4），发现2种原生质体皆无DMPO-OH·的EPR 谱的典型谱线，可能是原生质体含有的金属离子影响了 DMPO-OH· 的EPR谱信号，但仍可通过信号强弱判断相对羟自由基含量的高低。对于愈伤组织原生质体，在培养的0、3、6 d，0 d的DMPO-OH·的信号最强，3 d时减弱，6 d时又增强（图3）；而叶肉原生质体在3 d时DMPO-OH·的信号最强，6 d时最弱（图4），这些研究结果与产羟自由基能力测定结果一致。可见，该方法能快速检测原生质体或细胞中羟自由基变化。此外，对于如何消除或减少细胞内其他成分对羟自由基信号的干扰还有待进一步研究。

2.3流式细胞仪测定椪柑原生质体培养过程中总活性氧含量变化

由于各种活性氧能氧化荧光染料DCFH-DA成发强绿色荧光的DCF，利用流式细胞仪检测细胞胞内的DCF荧光强度即可反映细胞的总活性氧水平。本研究中也采用该方法检测了原生质体在培养6 d过程中总活性氧含量的变化。结果

表明，刚分离的愈伤组织原生质体具有较高水平的活性氧，但在培养3 d时显著下降，之后略有降低。而叶肉原生质体的活性氧含量在培养前3 d无显著差异，即前期保持较高的活性氧水平，之后下降（图5）。

3讨论

在正常的代谢下，高等植物细胞不可避免地产生羟自由基、超氧阴离子和过氧化氢等活性氧，逆境条件下活性氧会过多积累，易引起氧化胁迫，引发或加剧膜脂过氧化，甚至造成细胞死亡。在葡萄、油菜、烟草等几种植物上开展的研究结果表明，活性氧的水平对原生质体再生能力会产生一定的影响[5-7]，因此本研究检测了羟自由基和总活性氧水平的变化。椪柑愈伤组织原生质体和叶肉原生质体在培养的6 d过程中，其羟自由基和总活性氧含量表现出不同的变化规律。目前已知，原生质体分离是一个逆境过程，易引起活性氧的过多积累，会造成细胞的损伤或死亡[12-14]。因此，培养早期活性氧的控制是原生质体重新进入细胞周期的关键。本研究中，在培养的前3 d，愈伤组织原生质体的羟自由基和总活性氧水平都下降。考虑到分离后愈伤组织原生质体的抗氧化酶（超氧化歧化酶、过氧化物酶）活力和抗氧化物质含量（还原型维生素C、还原型谷胱甘肽）都升高[10]，因此我们认为分离后抗氧化系统的激活是原生质体再生的必要条件。而对于不可分裂再生的叶肉原生质体，培养的前3 d，其羟自由基和总活性氧水平略有升高，这可能是造成其大量死亡的重要原因之一。在培养的后3 d，愈伤组织原生质体的总活性氧水平略有下降，而羟自由基含量上升，此外过氧化氢含量也是上升的[10]，我们分析愈伤组织原生质体的羟自由基升高可能与细胞壁再生及分裂有关。可见，活性氧在原生质体再生中具有双面性，既会造成原生质体再生难，也会对原生质体再生起重要的调控作用。

虽然我们的研究已清楚了氧化胁迫是椪柑愈伤组织原生质体与叶肉原生质体再生能力差异的原因。但仍有一些问题有待解决。如抗氧化物质的添加是否可以促进原生质体再生？2种类型的原生质体其活性氧主要分布在哪些部位？主要相关基因是哪些？部分工作已在进行中，相信随着研究进一步的深入，将揭示柑橘原生质体再生能力差异的机制，同时为促进利用原生质体再生体系进行柑橘及其他果树遗传改良和种质创新奠定理论与技术基础。

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