GC法测定市售动物源性中药材地龙、水蛭中3种氯霉素类药物的残留量

王鹏思，李嘉欣，石上梅，薛 健*

(1. 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京100193；2. 国家药典委员会，北京 100061)



GC法测定市售动物源性中药材地龙、水蛭中3种氯霉素类药物的残留量

王鹏思1，李嘉欣1，石上梅2*，薛 健1*

(1. 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京100193；2. 国家药典委员会，北京 100061)

为了建立柱前衍生-GC-ECD法同时测定市售动物源性中药材地龙、水蛭中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素3种氯霉素类抗生素残留量的方法，样品经乙酸乙酯超声提取，旋转蒸干后，提取物溶于4%氯化钠溶液，经正己烷去脂，液液分配净化。再加BSTFA-TMCS衍生化反应后氮气吹干，正己烷定容进样分析，外标法定量。结果表明，氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素在0.1～20 μg/L范围内线性关系良好，相关系数r2≥0.9989；空白样品加标实验表明，氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素在1、5、10 μg/kg这3个添加水平下的回收率为62.9%～100.8%，RSD<16%，其检出限分别为 0.05、0.1、0.1 μg/kg。该方法简便快捷，准确度和精密度高，适用于地龙、水蛭中氯霉素类药物的残留测定。

中药材；地龙；水蛭；氯霉素类药物；残留量；气相色谱

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)、甲砜霉素(Thiamphenicol，TAP)、氟甲砜霉素(又称氟苯尼考，Florfenicol，FF)同属于氯霉素类广谱抗生素，在畜牧业、渔业中广泛应用。但研究发现氯霉素存在严重的毒副作用，可引起人类的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症、新生儿和早产儿灰色综合症等疾病，低浓度的药物残留还会诱发致病菌的耐药性[1]。甲砜霉素是氯霉素的类似物，被称为第二代氯霉素，氟甲砜霉素是甲砜霉素的氟化衍生物，被称为第三代氯霉素，这两种药物有效地克服了氯霉素导致再生障碍性贫血的缺陷[2]。但甲砜霉素有比氯霉素强5倍的免疫抑制作用，且抗菌效果不及氯霉素和氟甲砜霉素，因此限制了它的临床使用[3]。氟甲砜霉素的毒副作用较小，在兽医临床上应用广泛[4]。

目前，对以上3种药物残留量的检测方法主要有气相色谱法、气-质联用法、高效液相色谱法、液-质联用法、酶联免疫法[5-12]等，检测对象主要包括肉类、乳制品、水产品、禽畜饲料、土壤及禽畜粪[5-12]等。由于地龙主食发酵的鸡粪、猪粪、牛羊粪和生活垃圾[13]，水蛭主食螺蛳、河蚌、青虾、龟鳖、蚯蚓、草虾以及哺乳类动物的血液[14]，故地龙、水蛭体内也可能有氯霉素类药物残留。加之目前对动物源性中药材中氯霉素类药物的残留检测鲜有报道，本试验选取地龙、水蛭两味中医临床常用且疗效显著的中药材，测定其中氯霉素类药物的残留量，这既可保障人民用药安全，亦对两味药材的进出口贸易意义重大。

1 材 料

1.1 仪器与设备 Agilent 7890A气相色谱仪(配μ-ECD检测器)，色谱柱为毛细管色谱柱(Agilent HP-5，30 m×0.32 mm ×0.25 μm)，载气为高纯氮气(纯度≥99.999%，北京氦普北分气体工业有限公司)；HGC-12A氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司)；HEI-VAP型旋转蒸发器(德国海道夫)；HH-22恒温水浴锅(郑州长城科工贸有限公司)；TP-150超声波清洗机(北京天鹏电子新技术有限公司)；SHB-B循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；80-2型高速离心机(江苏省金坛市医疗仪器厂)；WH-1涡旋混合仪(上海沪西分析仪器厂)；PL203/01电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；Eppendorf单通道可调移液枪(10～100μL、20～200μL、100～1000μL)；C18固相萃取小柱(1000 mg/6 mL填料，德国CNW公司)；Florisil固相萃取小柱(1000 mg/6 mL填料，美国Agilent公司)等。

1.2 药品与试剂 氯霉素标准品(纯度99.3%，中国药品生物制品检定所)；甲砜霉素标准品(纯度99.7%，中国药品生物制品检定所)；氟甲砜霉素标准品(纯度99.3%，中国药品生物制品检定所)；N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)：纯度98%，阿拉丁试剂；三甲基氯硅烷(TMCS)：纯度98%，国药集团；色谱纯甲醇(4 L/瓶，Fisher公司)；分析纯甲醇、乙腈、正己烷、丙酮、乙醚、吡啶、甲苯、无水硫酸钠、氯化钠(北京化工厂)等。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制 参照农业部958号公告-14-2007《水产品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素残留量的测定气相色谱-质谱法》配制100 μg/mL氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素标准储备溶液，10 μg/mL氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合标准储备溶液，0.2 μg/mL氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合标准使用溶液，4%氯化钠溶液及BSTFA-TMCS(体积比为99∶1)衍生化试剂。

2.2 样品前处理

2.2.1 样品的提取 准确称取2.0 g样品于100 mL具塞锥形瓶中，加入30 mL乙酸乙酯，超声提取30 min，静置，过滤，滤渣重复上述操作一次，合并两次滤液至100 mL茄形瓶中，40 ℃水浴旋转浓缩至干，加入5 mL 4%的氯化钠溶液超声，将溶液转移至10 mL具塞玻璃试管中，加入5 mL正己烷，涡旋，将试管置离心机中，以3000 r/min离心10 min，取出试管，弃掉正己烷层，以去除脂肪，重复操作一次。

2.2.2 样品的净化 向除去脂肪、蛋白质的氯化钠水溶液中加入5 mL乙酸乙酯涡旋，静置分层，吸取有机相至10 mL具塞玻璃试管中，再分别用3、2 mL乙酸乙酯提取两次，合并有机相，过装有5 g无水硫酸钠的小柱，以除去水分，再用5 mL乙酸乙酯洗涤无水硫酸钠的小柱，合并洗脱液至50 mL茄形瓶中，40 ℃水浴浓缩至近干，加入1 mL乙酸乙酯溶解茄形瓶中的残渣并转移至5 mL刻度试管中，再用2 mL乙酸乙酯清洗茄形瓶，清洗液亦转移至5 mL刻度试管中，50 ℃下氮气吹干待衍生化。

2.2.3 样品的衍生化 取上述吹干后待衍生化的残渣加入100 μL衍生化试剂BSTFA-TMCS与100 μL反应介质吡啶，70 ℃水浴加热60 min进行衍生化反应，反应完成后氮气吹干，放至室温用正己烷定容至1 mL，转移至2 mL进样小瓶中，待GC检测。

2.3 色谱测定条件 Agilent HP-5毛细管色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；升温程序：80 ℃保持1 min，50 ℃/min升温至200 ℃，20 ℃/min升温至260 ℃保持5 min，5 ℃/min升温至280 ℃；进样口温度为250 ℃；载气为高纯氮气，流速1 mL/min；检测器温度为300 ℃；进样量为1 μL，不分流进样。混合标准品和样品色谱图见图1、图2。

B.地龙空白样品色谱图;C.地龙加标样品色谱图图1 氯霉素类药物混合标准品溶液(A)和地龙样品(B、C)气相色谱图

B.水蛭空白样品色谱图;C.水蛭加标样品色谱图图2 氯霉素类药物混合标准品溶液(A)和水蛭样品(B、C)气相色谱图

2.4 线性关系考察 用2.1.3混合标准使用溶液分别配制出0.1、1、5、10、20 μg/L的混合标准溶液，将不同浓度的混合标准溶液按2.2.3项下衍生化后，按2.3项下条件进行GC-ECD测定。以峰面积Y为纵坐标，以试样浓度X(μg/L)为横坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得氯霉素的回归方程为：Y=103.92X-57.791，r2=0.9993，氟甲砜霉素的回归方程为：Y=32.945X+31.982，r2=0.9989，甲砜霉素的回归方程为：Y=81.725X-249.37，r2=0.9990。表明本方法氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素在0.1～20 μg/L浓度范围内线性关系良好。2.5 准确度和精密度考察 分别准确称取空白本底的地龙、水蛭样品2.0 g于100 mL具塞锥形瓶中，加入浓度分别为1、5和10μg/L的3种氯霉素类药物混合标准品溶液2 mL(精密量取)，充分混匀，放置过夜。使空白样品中氯霉素类药物的添加水平为1、5、10 μg/kg 3个水平(每个水平3个平行)。按照2.2样品前处理及2.3色谱测定条件进行测定，计算加标回收率和相对标准偏差，结果见表1。

由表1可知，氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素在1、5、10 μg/kg 3个添加水平下的回收率为62.9%～100.8%，RSD<16%，符合氯霉素类药物残留测定的要求。

表1 地龙、水蛭中三种不同浓度氯霉素类药物混合标准溶液添加回收率(n=3)

2.6 检出限和定量限的确定 分别取地龙、水蛭空白样品，按照样品前处理程序处理后上机测定，另取多份空白样品，分别加入不同的较低浓度的氯霉素类药物混合标准工作液，按照样品前处理程序处理后上机测定，对比两者，S/N=3时的药物浓度即为检出限，S/N=10时的药物浓度即为定量限。本试验所建立的检测方法测得氯霉素的检出限和定量限分别为0.05、0.17 μg/kg，甲砜霉素、氟甲砜霉素的检出限和定量限分别为0.1、0.33 μg/kg。

2.7 样本测定结果 从北京10家药店随机购买样本10份，均未检出氯霉素类药物。

3 讨论与分析

3.1 提取溶剂的选择 氯霉素类药物为弱极性物质，微溶于水，易溶于乙腈、甲醇、丙酮和乙酸乙酯等有机溶剂，甲醇、乙腈这两种溶剂对人体毒性较大，而且乙腈在挥干时容易冒泡，挥干时间较长[5，15-16]，参考《GB/T 22338-2008 动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》中气相色谱-质谱法，本试验选择乙酸乙酯作为提取剂。

3.2 净化方式的选择 李鹏等[7]测定动物组织中氯霉素类药物残留量时采用Florisil柱净化，农业部958号公告-14-2007《水产品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素残留量的测定气相色谱-质谱法》采用C18固相萃取柱净化，吴明媛[6]、冷凯良等[17]采用乙酸乙酯反萃取净化。本试验对3种净化方法均进行了试验，结果显示采用Florisil SPE柱净化时氯霉素类药物的回收率比较低，采用C18 SPE柱和乙酸乙酯液液萃取净化时氯霉素类药物的回收率均在75%以上。综合样品净化的回收率结果、操作的简便性和耗材费用等方面的因素，确定地龙药、水蛭药材中3种氯霉素类药物残留测定方法中样品的净化方法为：用10 mL乙酸乙酯分3次(5 mL+3 mL+2 mL)萃取净化。

3.3 药材样本的测定 在对10批地龙、水蛭样本的测定中，未检出氯霉素类药物的残留，参照中华人民共和国农业部2002年235号公告《动物源性食品中兽药最高残留限量》中的规定：氯霉素为禁止使用的药物，在动物性食品中不得检出；甲砜霉素最大残留限量为50 μg/kg；氟甲砜霉素在其他动物的肌肉中的最大残留限量为100 μg/kg。本批样本氯霉素类药物的残留符合规定。但值得注意的是，研究着重于建立一种测定动物源性中药材地龙、水蛭中3种氯霉素类药物残留量的方法，所测的地龙、水蛭样本数量不足，因此要想全面了解地龙、水蛭中氯霉素类药物的残留情况，还需增加对不同品种、不同地区和不同炮制方式等更多样本的测定。

4 小 结

建立了GC-ECD法同时测定动物源性中药材地龙、水蛭中3种氯霉素类药物残留量的方法，本法灵敏度高，氯霉素的检出限可达到0.05 μg/kg，甲砜霉素和氟甲砜霉素的检出限可达到0.1 μg/kg。该方法前处理步骤相对简单，处理后杂质干扰少，具有较强的适用性。

[1] 高林．氯霉素的不良反应及其残留检测方法研究进展[J]．动物医学进展，2010，31(4)：90-95．

[2] 李红权，孙良娟，伍志强，等．高效液相色谱串联质谱法同时测定饲料中氯霉素、甲砜霉素与氟甲砜霉素残留[J]．中国实验方剂学杂志，2012，,31(11)：1396-1400．

[3] 琚大伟，阮祥春，吴虹，等．甲矾霉素残留检测研究进展[J]．中国蜂业，2011，62(Z3)：56-60．

[4] 孙兴南．氟苯尼考在基层动物诊疗应用中存在的问题及对策[J]．云南畜牧兽医，2015，44(5)：33-34．

[5] 刘永涛，李荣，袁科平，等．气相色谱法同时测定水产品中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素残留量[J]．淡水渔业，2007,37(2)：44-47．

[6] 吴明媛，杨姝丽，黎小正，等．毛细管电子捕获气相色谱法同时测定水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留[J]．广西农业科学，2009，40(5)：567-570．

[7] 李鹏，邱月明，蔡慧霞，等．气相色谱-质谱联用法测定动物组织中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素的残留量[J]．色谱，2006，24(1)：14-18．

[8] 曾芳，黄玉芬，刘忠珍，等．高效液相色谱法测定土壤和畜禽粪中的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素[J]．广东农业科学，2010，37(10)：38-40．

[9] 潘晓东，吴平谷，姜维．超高效液相色谱-串联质谱法同时测定鱼肉中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素[J]．中国食品卫生杂志，2014，26(6)：572-574．

[10]胡雪，李翠枝，刘丽君，等．UPLC-MS-MS法测定饲料、原料乳及乳制品中3种氯霉素类药物残留[J]．食品科学，2014，35(16)：110-113．

[11]周晓芳，张淑萍，王僧虎，等．ELISA方法检测氯霉素的质量评价[J]．北京农学院学报，2010，25(4)：1-3．

[12]刘智宏，黄耀凌，汪霞，等．水产品中甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺酶联免疫多残留测定[J]．中国兽药杂志，2010，44(12)：1-5．

[13]刘红军，尹文生．蚯蚓养殖技术与加工利用[J]．现代农业科技，2016，23(1)：9296-9297．

[14]常东洲，李同国．水蛭的生物学习性及人工养殖技术[J]．科学养鱼，2000，15(12)：18．

[15]刘耀川，赵刚，刘军骅，等．氟苯尼考的研究进展及应用[J]．现代畜牧兽医，2011，40(2)：44-46．

[16]李佩佩，张小军，梅光明，等．超高效液相色谱-串联质谱法检测渔用饲料中氯霉素类药物[J]．中国渔业质量与标准，2013，3(3)：44-50．

[17]冷凯良，孙伟红，王志杰，等．GC/MS 法同时测定水产品中氯霉素、氟甲砜霉素及甲砜霉素残留量[J]．海洋水产研究，2007，28(5)：95-99．

(编辑：陈希)

Determination of 3 Chloramphenicols Medicine Residuesin Animal-origin Chinese Medicinal Materials Pheretima and Hirudoin the Retailer by Gas Chromatography

WANG Peng-si1，LI Jia-xin1，SHI Shang-mei2*，XUE Jian1*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalScience&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China；2.ChinesePharmacopoeiaCommission，Beijing100061，China)

Pre-column derivatization GC-ECD method was established to simultaneously determine the residues of chloramphenicol(CAP)，thiamphenicol(TAP) and florfenicolin(FF) in animal-original Chinese medicinal materials pheretima and hirudo in the retailer．The samples were extracted with ethylacetate by ultrasound assistance and evaporated to dry．The extracts were dissolved in 4% sodium chloride solution，defatted with n-hexane，and cleaned up by liquid-liquid partition．The purified extracts were derivatized with BSTFA-TMCS and derivatization solution was dried under nitrogen．The final targets were dissolved with n-hexane and quantitatived by external standard method．The results indicated that the calibration curves of chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol were linear in the ranges of 0.1～20 μg/L，with correlation coefficients not less than 0.9989.Recoveries of chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol spiked in blank samples at three levels of 1，5，10 μg/kg were 62.9%～100.8%，and the relative standard deviation(RSD) was less than 16%，the limits of detection(LODs)were 0.05，0.1，0.1 μg/kg respectively．With the advantages of simplicity，rapidity，high accuracy and precision，this method could be suitable for the detection of chloramphenicols medicine residues in pheretima and hirudo．

Chinese medicinal materials；pheretima；hirudo；chloramphenicols medicine；residues；gas chromatography

王鹏思，硕士研究生，从事中药质量方面研究。

石上梅，E-mail:ssm@chp.org.cn；薛健，E-mail:xuejian200@sina.com

2016-10-28

A

1002-1280 (2017) 03-0065-05

S853.7