不同地理种群白纹伊蚊线粒体基因COI的遗传多样性分析

张瑞玲，姚广琴，潘晓倩，马德珍，赵爱华，张 忠



不同地理种群白纹伊蚊线粒体基因COI的遗传多样性分析

张瑞玲1,2，姚广琴2，潘晓倩2，马德珍3，赵爱华3，张 忠1,2

目的 探讨白纹伊蚊不同地理种群间的进化关系和遗传分化情况，为白纹伊蚊防制和蚊媒病防控提供基础资料。方法 在广泛采集样品的基础上，通过PCR扩增、测序获取线粒体基因COI片段，并从GenBank下载了部分序列，比对、剪切后的598 bp用于后续分析。结果 系统发育分析的结果表明所有白纹伊蚊的COI序列聚成一支，没有明显的遗传差异；60条COI序列分属于19个单倍型，其中4个为共享单倍型；单倍型多样性(Hd)为0.737，核苷酸多样性(π)为0.20%；海南的白纹伊蚊种群与绝大部分地理种群间出现了明显的分化(P<0.05)；H1和H6形成了2个辐射中心，是较为原始的单倍型。结论 我国的白纹伊蚊种群正处于扩张的趋势，海南的白纹伊蚊种群与其它地理种群间出现了明显分化。

白纹伊蚊；地理隔离；瓶颈效应；蚊媒病

白纹伊蚊(Aedesalbopictus)又称“亚洲虎蚊”，隶属于双翅目，蚊科，伊蚊属，是中国常见蚊种之一。白纹伊蚊是登革热、黄热病、基孔肯雅热、西尼罗热等多种病毒的重要传播媒介。近些年来，蚊媒病在全球的流行呈现明显增加的趋势，其中许多是传播力强、流行面广、发病率高、危害性大的疾病，已经成为世界性的公共卫生问题[1]。当前，由于登革热等蚊媒病尚无特效药物和疫苗，对传播媒介白纹伊蚊的防制是预防和控制蚊媒病疫情的主要手段。

蚊虫传播病原体的能力受其遗传因素的影响，研究证据表明地理来源不同的白纹伊蚊种群和个体对登革热病毒的易感性和传播能力有所不同[2-3]。因此，不同白纹伊蚊种群遗传背景的深入了解将对蚊媒病的防控具有重要的意义。在长期的进化过程中，受到环境选择压力、突变、遗传漂变等因素的影响，不同地理种群的蚊虫间在基因交流、遗传多样性方面都会出现变化。利用分子生物学的方法，结合生态、分布格局、种群动态和遗传多样性等多个方面的资料，探讨白纹伊蚊不同地理种群间的分化，不仅有助于阐明不同地理种群间的遗传结构和扩散动态，还可以了解它们传播疾病能力之间的差异，是用于制定合理高效防控措施的可靠理论依据[4]。

我国研究人员已开展了大量相关研究，但多局限于某一地区种群遗传结构的探讨[5-7]。本文基于前期在全国范围内广泛采样的基础上，利用线粒体基因COI(Cytochrome C Oxidase Subunit I)初步分析了我国不同地区白纹伊蚊的遗传结构和系统发育关系，以期为蚊媒病有效防治策略的制定提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品 本研究所用样品的采集信息见表1。所有标本浸泡于95%无水乙醇中于-20 ℃保存备用。基于形态学特征对采集样本进行物种鉴定。

1.2 DNA 提取、基因扩增及测序 取单头个体，使用组织/细胞 DNA 快速提取试剂盒(北京全式金生物技术)，按说明书步骤进行提取，提取到的DNA于-20 ℃条件下保存备用。PCR上游引物为LCO1490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG；下游引物为HCO2198：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA。扩增体系为30 μL，其中DNA模板2 μL；TaqDNA聚合酶0.4 μL；正反向引物各0.6 μL；10 × buffer，3 μL；dNTPs，2.4 μL；ddH2O，21 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，45 ℃复性50 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。

扩增反应结束后，取3 μL PCR产物于琼脂糖凝胶(2%)上，置于电泳槽中电泳(120 V，30 min)检测，电泳缓冲液为1×TAE。同时，电泳过程中选用DNA Marker 进行目的基因长度的确认，PCR产物经电泳检测后，送北京六合华大基因科技有限公司进行纯化和测序。

1.3 数据分析 所得双向测序结果利用DNAStar 7.1(DNASTAR, Inc. 1996)软件包中的Seqman程序进行序列拼接和编辑，确定序列的方向，然后将这些序列在NCBI中进行BLAST同源性比对，以确保所得到的是目标序列。序列在MEGA 5.0软件[4]中进行编辑和比对，包括：1)位点的手工筛查和纠正；2)将DNA序列翻译成相应的氨基酸序列，以检查序列内是否有终止密码子的存在；3)碱基组成分析，变异位点、简约信息位点及保守位点的计算。

系统发育分析选用三带喙库蚊(Culextritaeniorhynchus)(GenBank登录号：KJ012246、KJ768093、KT358420)作为外群。采用 PAUP*4.0[8]构建最大似然树(Maximum Likelihood, ML)。用DnaSP 5.0[9]计算单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Nucleotide diversity，π)。使用Arlequin 3.5[10]估算种群间的分化系数Fst(F-statistics)。使用Network 4.6.1.3软件[11]基于Median-joining方法构建了单倍型的网络关系图。

2 结 果

2.1 遗传多样性和系统发育分析 本研究测得以及GenBank下载获得的白纹伊蚊COI序列共计60条，比对处理后用于后续分析的序列长度为598 bp，无插入和缺失突变。共检测到579个保守位点和19个可变信息位点，利用DnaSP分析共定义19个单倍型，其中有4个共享单倍型(shared haplotype)，15个私有单倍型(singletons)(表1)。该物种的单倍型多样性(Hd)为0.737，核苷酸多样性(π)为0.20%。不同地理种群单倍型多样性差异明显，其中四川(Hd=0.504，π=0.08%)、广西(Hd=1.000，π=0.25%)、广东(Hd=0.454，π=0.11%)、台湾(Hd=1.000，π=0.33%)和北京(Hd=0.833，π=0.26%)，山东、浙江和海南的种群多样性较低。

表1 白纹伊蚊样品信息和单倍型分布

*：数字表示用于分析的序列总数，括号内表示自NCBI下载序列的序列号

**：下划线标示共享单倍型

*：Arabic numeral represents total sequences used for analysis, and accession number of downloaded sequences was showed in bracket

**：Shared haplotype was marked with underline

以三带喙库蚊为外群，构建的ML树显示所有白纹伊蚊的COI序列聚成一支，支持率为100%，表明不同地理种群间没有明显的分化(图1)。

2.2 种群遗传结构分析和单倍型网络图 种群分化系数(Fst)常用来表示种群间的分化程度，Fst接近于0时，说明种群间没有发生遗传分化。根据种群间两两比对的结果可以看出(表2)，山东、四川、广西、广东、浙江和台湾的白纹伊蚊种群间没有明显的分化(P>0.1)；北京和四川、广东之间的分化系数分别为0.307和0.395，但分化有统计学意义(P<0.05)。海南的白纹伊蚊种群与其他7个种群间的分化系数介于0.593～1.000之间，且除与台湾种群的分化无统计学意义，与其他6个种群间的分化有统计学意义(P<0.05)。

表2 基于COI序列的白纹伊蚊地理种群间遗传分化系数(Fst)

*：P< 0.05

图1 基于线粒体基因COI构建的ML树Fig.1 Maximum likelihood tree constructed based on mitochondrial gene COI

从单倍型网络图中可以看出，单倍型H1和H6处于中间的位置，形成2个辐射中心，是比较原始的单倍型(图2)。H1是分布最广的单倍型，包括了山东、陕西、四川、云南、广西、广东、湖南、浙江、江苏和北京的样品，并辐射进化出12个单倍型，说明H1是较为古老的单倍型。北京和广西的部分样品组成了以H6为原始单倍型的星状网络图。

3 讨 论

白纹伊蚊具有扩散能力强、环境可塑性高等特点，且与人类关系密切，分布区易于受到人为因素的影响，携带有蚊卵和幼虫的废旧轮胎及金属容器等是其向潜在适生区扩散的常见方式。频繁的货物运输和人员往来促进了白纹伊蚊的扩散和流动，所以不同地理种群的白纹伊蚊样品在系统进化树上聚成一支(图1)。该物种的单倍型多样性(Hd)为0.737，核苷酸多样性(π)仅为0.20%，较高的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性表明不同地理种群可能经历过“瓶颈效应”，之后伴随着种群快速增长的历史事件，但扩张历史较短，核苷酸变异积累不充分[12]。基于Median-joining方法构建的单倍型网络关系图出现了两个辐射进化中心，均呈星状分布。其中分布最广的H1是最原始的单倍型，辐射进化出多个单倍型；H6可能是由H1分化而来，又逐渐分化出北京和广西地理种群的私有单倍型。“星状系统发育关系(star phylogeny)”也支持了我国白纹伊蚊不同地理种群是经历“种群瓶颈”后开始扩张的种群[13]。

Each cycle represent a haplotype, the area of the circle is proportional to the frequency of haplotype. Different geographical populations were shown in different colors.图2 基于线粒体COI构建的Median-joining单倍型网络关系图Fig.2 Median-joining haplotype network construction based on mitochondrial gene COI

不同地理种群间的分化系数Fst值也有明显的差异，大部分种群间的分化不明显，但海南种群与其它地理种群间的Fst值均较大，且达到显著水平，其中海南种群和浙江种群间的Fst值为1.0，表明是这两个种群达到了完全的隔离分化。这可能是与海南岛与其它地区的地理隔离有关系，白纹伊蚊的主动扩散能力弱，岛屿的地理隔离导致基因交流受阻，部分地理种群间出现了遗传分化。此外，这也可能是与本研究所涵盖的地理群体和研究样品较少有关，上述研究结果并不排除在其它未取样地区存在不同或与现有结果不一致的现象。增大样本量和种群覆盖面，研究结果可能将会更加客观。

随着全球气候变暖，生态环境和生物群落都随之发生改变，白纹伊蚊的密度及其地理分布也在发生变化。目前全世界都面临着虫媒病的重大威胁，其中相当一部分属于蚊媒病。近几年登革热疫情持续加重，给社会和经济发展带来沉重负担。但持续扩张中的白纹伊蚊种群间分化水平很低，频繁的基因流是保持种群间不出现分化的重要因素，同时基因流也使得不同地理种群白纹伊蚊具有相似的带毒能力，因此蚊媒病的防控任务仍很艰巨。

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Zhang Zhong, Email：zhangz@tsmc.edu.cn

Genetic diversities of different geographical populations ofAedesalbopictusbased on mitochondrial gene COI

ZHANG Rui-ling1,2, YAO Guang-qin2, PAN Xiao-qian2, MA De-zhen3, ZHAO Ai-hua3, ZHANG Zhong1,2

(1.CollaborativeInnovationCenterfortheOriginandControlofEmergingInfectiousDiseases,TaishanMedicalUniversity,Tai’an271016,China; 2.DepartmentofPathogenicBiology,Tai’anMedicalUniversity,Tai’an271016,China; 3.TaianMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention,Tai’an271000,China)

In order to figure out phylogenetic relationship and genetic diversity of different geographical populations, genetic analyses ofAedesalbopictuswere performed based on mitochondrial gene COI. Based on samples collected from most distribution regions in China, mitochondrial gene Cytochrome C Oxidase Subunit I was obtained through PCR and DNA sequence. Together with some COI sequences downloaded from GenBank, 60 COI sequences with the final length of 598 bp were used for subsequent analyses. Results showed that there was no obvious divergence according to phylogenetic analyse, all sequences were clustered together in Maximum Likelihood tree. Sixteen haplotypes were detected, and four of them shared haplotypes. Haplotype diversity (Hd) was 0.737, nucleotide diversity (π) was 0.20%. Population genetic differentiation analyses demonstrated that Hainan population showed obvious divergences. In the network of haplotypes, H1 and H6 was found to be the primary haplotypes, and they formed two radical centers. All these results indicate thatA.albopictuspopulations of China are expanding presently, and Hainan population become differential with other geographical populations, which probably attribute to geographical isolations.

Aedesalbopictus; geographical isolation; bottleneck effect; mosquito-borne disease

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.04.005

国家自然科学基金(Nos.81401693&81572028)和大学生创新创业训练计划(No.201510439010)联合资助

张 忠，Email：zhangz@tsmc.edu.cn

1.泰山医学院新发传染病溯源及防控协同创新中心，泰安 271016； 2.泰山医学院基础医学院，泰安 271016； 3.泰安市疾病预防控制中心，泰安 271000

Supported by the Natural Science Foundation of China (Nos. 81401693 & 81572028) and the Student’s Platform for Innovation and Entrepreneurship Training Program (No. 201510439010)

R384.1

A

1002-2694(2017)04-0316-05

2016-08-02 编辑：刘岱伟