结扎腰动脉建立大鼠脊髓缺血模型有效性的评估

2017-04-25何祥中陈春美

福建医科大学学报 2017年1期

何祥中，陈春美，韦浩，张帆

何祥中1，陈春美2，韦浩1，张帆1

目的结扎腰动脉建立大鼠脊髓缺血模型，为研究缺血性脊髓病、继发性脊髓损伤的发生机制提供良好的载体。方法将大鼠随机分为假手术组(仅分离出腰动脉)和脊髓缺血组(结扎所有腰动脉)，于术后进行大鼠后肢运动功能BBB评分、脊髓苏木精-伊红(H-E)染色镜下观察及Caspase-3免疫组织化学检测。结果术后48 h对缺血组大鼠后肢运动功能BBB评分为(9.22±0.97)，与对照组比较，差别有统计学意义(P<0.01)；H-E染色镜下可见脊髓缺血组大鼠正常神经元数目明显减少；免疫组织化学显示Caspase-3阳性细胞呈棕黄色，脊髓缺血组阳性率远大于假手术组，差别有统计学意义(P<0.01)。结论通过结扎大鼠腰动脉可以建立稳定的脊髓缺血模型，为脊髓缺血后损伤机制和预防措施的研究提供良好的载体。

动脉；脊髓缺血；模型，动物

脊髓缺血疾病常见于脊柱脊髓损伤、胸腹主动脉瘤手术或血栓性疾病等，其发病率也呈逐渐增高的趋势。目前国内外关于脊髓缺血再灌注动物模型制作方法种类繁多，制作动物模型的研究虽不断改进，但仍是当前国内外致力探讨的课题[1]。Kwun等首次通过结扎兔腰动脉建立了脊髓缺血模型，这个模型的最大优点就是避免了因阻断腹主动脉所产生的内脏及后肢损伤[2]。本研究拟在Kwun的脊髓缺血模型及本课题组前期对大鼠腰动脉解剖研究基础上[3]，通过结扎大鼠5根腰动脉建立脊髓模型，并进行大鼠后肢运动功能BBB评分、脊髓苏木精-伊红(H-E)染色镜下观察及Caspase-3免疫组织化学检测等评估，旨在建立稳定的大鼠脊髓缺血模型，为研究缺血性脊髓病、继发性脊髓损伤的发生机制提供良好的载体。

1 材料与方法

1.1 材料清洁级纯系健康雄性SD大鼠(上海斯莱克实验动物中心,许可证号:SCXK 沪2012-0008)，体质量300～350 g；兔抗鼠Caspase-3多克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)；二步法免疫组织化学检测试剂盒(北京中杉金桥生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备将20只SD大鼠随机分为假手术组和脊髓缺血组各10只(每组大鼠分别编号为1-10)。假手术组SD大鼠仅分离出腰动脉，不进行结扎；脊髓缺血组分离出双侧所有腰动脉，并将其结扎。10%水合氯醛(0.35 mg/kg)将大鼠腹腔麻醉后，仰卧位固定于手术台上，常规消毒，取腹部左侧切口，暴露腹主动脉，在显微镜下首先找到左肾动脉、髂腰动脉及荐中动脉，并依次找到5根腰动脉(图1)，每根腰动脉用2根4#手术缝线结扎，靠中间剪断，用绵片将大鼠腹腔血迹擦拭干净，在显微镜下再次仔细观察有无活动性出血。确认无出血后，逐层缝合腹部肌肉、皮肤。假手术组只分离腰动脉，不结扎。术后脊髓缺血组大鼠每天肌内注射青霉素(50 mg/kg)防止感染。按摩大鼠膀胱帮助其排尿。

1.2.2 行为学评分术后48 h对2组大鼠后肢运动功能进行BBB评分[4]，本实验选用3名研究人员进行评价，记录结果后汇总。

1.2.3 H-E染色及免疫组织化学染色 BBB评分完成后取SD大鼠脊髓腰膨大标本，于4%多聚甲醛固定 24 h，脱水、石蜡包埋，5 μm厚度连续切片，进行H-E染色(光学显微镜下观察脊髓前角形态)及免疫组织化学染色(随机计算5个高倍视野下阳性细胞数占细胞总数的百分比)。

2 结果

2.1 BBB评分假手术组大鼠后肢活动自如，BBB评分为(20.57±0.50)；脊髓缺血组表现为偶见负重脚掌站立，无前后肢协调运动，BBB评分为(9.22±0.97)，二者比较，差别具有统计学意义(P<0.01)。

A：腰动脉(L1、L2、L3、L4)、荐中动脉(Lmsa)、左肾动脉(LRA)及髂腰动脉(LIA)；B：第5腰动脉(L5)，腰动脉“Y”型分支(LY)，第三和第四腰动脉相互交错(L3,4)；C：第三腰动脉缺如.图1 大鼠腰动脉解剖定位及变异Fig 1 The anatomy location and variation of rat’s lumbar arteries

其中，1例脊髓缺血组于结扎腰动脉术后8 h死亡，发现后立即将其腹腔打开，发现腹腔积有大量血块，并仔细解剖发现结扎腰动脉的缝线脱落，由于腰动脉活动性大量出血，大鼠休克致死。

2.2 H-E染色结果假手术组大鼠H-E切片脊髓组织结构完整，可见数个正常形态的神经元，细胞呈多角形，细胞核居中，呈圆形，细胞核轮廓清晰，胞膜完整(图2A)；脊髓缺血组可见正常神经元数目明显减少，前角神经元细胞核萎缩或溶解，呈凋亡和坏死样改变(图2B)。

A:假手术组; B：脊髓缺血组.图2 假手术组和脊髓缺血组脊髓前角H-E染色( ×200)Fig 2 The sham operation group and spinal cord ischemia group spinal cord anterior horn( ×200)

2.3 免疫组织化学检测结果假手术组大鼠免疫组织化学切片见细胞核及细胞质中均无Caspase-3阳性细胞明显表达(图3A)；脊髓缺血组细胞胞质中可见大量Caspase-3阳性细胞表达呈棕黄色，细胞核也可见少量阳性细胞表达(图3B)，表达阳性率为(82.1±7.41)%，远大于假手术组(1.82±0.74)%，二者比较，差别具有统计学意义(P<0.01)。

A:假手术组; B：脊髓缺血组.图3 假手术组和脊髓缺血组Caspase-3阳性细胞表达(DAB ×200)Fig 3 The sham operation group and spinal cord ischemia group Caspase-3 positive expression(DAB ×200)

3 讨论

脊髓缺血性损伤疾病是常见病、多发病，是目前研究的热点和难点之一。因此，建立理想的脊髓缺血损伤模型，阐明缺血性脊髓病、继发性脊髓损伤的发生机制，为临床救治提供指导具有重要意义。Zinvin等通过阻断兔子肾动脉下腹主动脉方法所建立的脊髓缺血模型是较为常用的传统脊髓缺血动物模型[2]。通过夹闭或者栓塞主动脉建立的脊髓缺血模型最大的优点就是能够完全阻断脊髓的供血动脉，使动物模型双下肢出现瘫痪，操作简单[5-6]。但这些模型也存在明显的缺点，因为把主动脉阻断后会产生内脏及后肢不可避免的损伤，对实验指标的准确观察产生了很大的影响。在众多脊髓缺血模型当中，Kwun等学者通过结扎兔腹主动脉肾脏以下的腰动脉所建立的脊髓缺血模型是比较符合临床上脊髓缺血的特点，与传统的脊髓缺血动物模型相比具有较大的优点，避免了因阻断腹主动脉所产生的内脏损伤及后肢功能障碍，而且创伤较少。但是由于兔子饲养相对较困难，价格昂贵，并且市场上目前用于兔研究的相关抗体较少。鉴于大鼠具有成本低、种系内纯合性好、抗感染和生命力强，价格便宜、容易饲养管理等特点，笔者前期已对大鼠的腰动脉进行了详细的解剖，为通过结扎腰动脉建立大鼠脊髓缺血模型提供了相关解剖学基础。

BBB评分法不是采用多项累计加分的方式，而是采用单个独立观察者对应单个相应分值的方式，且BBB评分的各个观察点包括了更为详细的特征和细节说明，所以BBB评分的判断结果更为客观和准确，结果可靠。当SD大鼠腰动脉都被阻断后，导致大鼠脊髓的血供减少，出现脊髓缺血性损伤，大鼠表现为后肢运动功能障碍。通过大鼠H-E切片结果可以看出，SD大鼠腰动脉都被阻断后，由于大鼠脊髓的血供减少，腰段脊髓前角运动神经元发生凋亡和坏死，才导致大鼠表现为后肢运动功能的障碍。脊髓缺血组大鼠免疫组织化学切片可见Caspase-3阳性细胞表达呈棕黄色，表达阳性率远大于假手术组，二者差别具有统计学意义。免疫组织化学结果进一步说明，脊髓缺血可导致脊髓前角运动神经元发生凋亡和坏死，导致后肢功能障碍。韩亚新等研究证实：大鼠脊髓缺血再灌注损伤后Caspase-1,Caspase-3及TUNEL阳性细胞表达明显，说明脊髓缺血再灌注损伤后存在神经细胞凋亡，Caspase-1及Caspase-3均参与损伤的调节，并可以作为大鼠脊髓缺血损伤的评价指标[7]，这与本研究结果一致。结合BBB评分结果、H-E染色及免疫组织化学结果，可以看出SD大鼠腰动脉都被阻断后，导致大鼠脊髓的血供减少，腰段脊髓前角运动神经元发生凋亡和坏死，进一步导致大鼠表现为后肢运动功能的障碍。同时，也说明通过结扎大鼠腰动脉所建立的脊髓缺血模型是稳定可靠的。

通过对SD大鼠的腰动脉解剖研究发现，大鼠腰动脉从腹主动脉的背面发出，共有5根，第一根位于左肾动脉略上方，第二根位于左肾动脉略下方，第三根和第四根通常位于髂腰动脉附近，且彼此之间距离很近，第五根发自荐中动脉背面，荐中动脉起于腹主动脉背侧末端；第三根和第四根腰动脉比较特殊，存在一些变异情况；可见腰动脉自腹主动脉发出后，在进入肌肉或即将进入肌肉可分为上下两支，呈“Y”型；5根腰动脉分别分布于腰肌及腰方肌，其较大的终支伴随脊神经经椎间孔进入脊髓，汇入脊髓的前、后正中动脉，参与脊髓的供血，与人体基本相似。所以，通过结扎SD大鼠5根腰动脉建立了脊髓缺血模型。脊髓缺血组10只SD大鼠，其中1例于结扎腰动脉术后8 h死亡，解剖发现结扎腰动脉的缝线脱落，腰动脉活动性大量出血，导致大鼠休克致死，说明在制作脊髓缺血模型的时候要认真止血。该模型也存在一定的局限性。由于大鼠的腰动脉相对比较细小，肉眼下进行结扎腰动脉有些困难，较容易损伤到腰动脉，所以需在显微镜下操作。结扎大鼠5根腰动脉可以建立稳定的脊髓缺血模型，且大鼠具有成本低、种系内纯合性好、抗感染和生命力强，价格便宜、容易饲养管理等特点，可为脊髓缺血后损伤机制和预防措施的研究提供良好的载体。

[1] 曾俊,方华,王泉云,等.兔脊髓缺血再灌注损伤的病理特征变化[J].四川医学,2007,28(5)：468-470.

[2] Kwun B D,Vacanti F X. Mild hypothermia protects against irreversible damage during prolonged spinal cord ischemia[J].JSurgRes,1995,59(6):780-782.

[3] 韦浩,陈春美,王春华,等.大鼠腰动脉解剖在脊髓缺血模型中的应用[J].中华实验外科杂志,2013,30(9)：1859-1860.

[4] Basso D M,Beattie M S,Bresnahan J C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats[J].JNeurotrauma,1995,12(1):1-21.

[5] Chou A K,Yang L C,Wu P C,etal. Intrathecal gene delivery of glial cell line-derived neurotrophic factor ameliorated paraplegia in rats after spinal ischemia[J].BrainResMolBrainRes,2005,133(2):198-207.

[6] Saklayen M G,Goldstein D L,Park Y S,etal. Animal model of spinal cord infarction induced by cholesterol embolization [J].AmJMedSci,1995,309(1):49-52.

[7] 韩亚新,王岩峰,屠冠军. 大鼠脊髓缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡及Caspase-1、Caspase-3的表达[J]. 解剖科学进展,2011,17(6):559-561, 565.

(编辑:张慧茹)

Evaluation of the Effectiveness of Lumbar Spinal Cord Ischemia in Rats

HE Xiangzhong1, CHEN Chunmei2, WEI Hao1, ZHANG Fan1

1. Department of Neurosurgery,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350009,China; 2. Department of Gastroenterology, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001,China

Objective To evaluate a mouse model produced by ligation of the lumbar arteries for study of spinal cord diseases and spinal cord injury. Methods SD rats were divided into the sham operation group and spinal cord ischemia group. In the spinal cord ischemia group the lumbar arteries were ligated while in the sham operation group we only separated out all lumbar arteries. BBB scoring of motor function of hindlimb of rats, the hematoxylin-eosin staining (H-E) and immunohistochemistry test were performed after the vascular ligation or the separation of the arteries. Results BBB score of motor function of hind limb of rats 48 hours after vascular ligation was (9.22±0.97), which was statistically significantly different than the BBB score in the sham operation (P<0.01). The result of spinal cord ischemia HE was that the number of normal neuron decreased. Immunohistochemistry showed that the sham operation group had only a few scattered yellow-brown positive cells of Caspase-3, while the spinal cord ischemia group showed numerous and densely distributed positive cells, and the difference was statistically significant (P<0.01). Conclusion By ligating the lumbar arteries in the rats, we can make stable spinal cord ischemia models therefore are able to supply an ideal model for spinal cord diseases and spinal cord injury research.

arteries；spinal cord ischemia；models, animal